ШТАММ STREPTOMYCES SP. - ПРОДУЦЕНТ РИФАМИЦИОНОКСИДАЗЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИФАМИЦИНОКСИДАЗЫ Российский патент 1995 года по МПК C12N9/04 C12P17/08 C12N9/04 C12R1/465 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению фермента, осуществляющего трансформацию рифамици- на В в рифамицин S через промежуточную cтадию образования рифамицина О.

Известны штаммы Humicola spp. и Monocillium spp. продуценты рифамициноксидазы. Все эти штаммы относятся к грибам.

Известен способ получения рифамициноксидазы путем культивирования штаммов Monocillium spp. (например, штамма АТСС 20621) или Humicola spp. (например, штамма АТСС 20620) в жидкой питательной среде, содержащей источники азота (например, соевую муку, гидролизат казеина, пептон, дрожжевой экстракт), источники углерода (например, глюкозу, лактозу), источники фосфора и микроэлементов (кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт) в течение трех дней при аэрации и перемешивании. Ферментная активность накапливается в мицелии. Клетки отфильтровывают, культуральную жидкость отбрасывают. Клетки или клеточный экстракт (клетки разрушают, например, действием ультразвука, супернатант после центрифугирования отделяют) хранят при 4^оС.

Недостатком указанного способа получения фермента с использованием известных штаммов являются низкий выход ферментной активности на стадии биосинтеза и необходимость разрушения клеток для концентрации ферментной активности, что нетехнологично.

Целью настоящего изобретения являются поиски нового штамма продуцента рифамициноксидазы, позволяющего повы- сить выход ферментной активности на стадии биосинтеза, и разработка нового способа получения фермента, позволяющего упростить процедуру концентрации ферментной активности.

Цель достигается изысканием нового штамма продуцента рифамициноксидазы, а именно, штамма актиномицетов Streptomyces sp. Г-473 (депонированного в коллекции ВНИИА под номером 2143).

Неизвестно использование актиномицетов в качестве продуцентов рифамициноксидазы.

Штамм Streptomyces sp. Г-473 был выделен из образца серой лесной почвы Тульской области и характеризуется следую- щими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Аэроб, оптимум роста 26-28^оС.

Образует воздушный мицелий серого, серо-белого, желтовато-серого, розовато-серого или белого цвета.

Спороносцы спиральные (S), cпоры с гладкой оболочкой.

Зрелые спороносцы содержат 10-50 спор в цепочке.

Воздушный мицелий может быть слабо развит.

Субстратный мицелий бесцветный (не имеет определенного цвета) или буровато-желтый, бурый, коричневый.

Растворимый пигмент отсутствует или бурый, коричневый.

Меланоидные пигменты образует.

В качестве источников углерода усваивает D-глюкозу, L-арабинозу, D-ксилозу, D-фруктозу, сахарозу, раффинозу, D-маннит, i-инозит, слабо усваивает рамнозу.

Описание культурально-морфологических признаков проводилось на 14-е сутки роста при 28^оС и приводится в табл.1.

Предлагаемый штамм Г-473 по описанным признакам близок к видам Streptomyces anandii и Streptomyces diastatochromogenes (определитель Гаузе Г.Ф. Преображенская Т.П. Свешникова М.А. Терехова Л.П. Максимова Т.С. "Определитель актиномицетов". М. Изд. "Наука", 1983), но отличается от них наличием желтовато-серого воздушного мицелия на овсяном агаре. От Streptomyces diastatoch- romogenes отличается также желтовато-серым воздушным мицелием на минеральной среде 1. На основании изложенного предложенный штамм Г-473 отнесен к неопределенному виду Streptomyces sp.

Цель достигается также и новым способом получения фермента.

Способ заключается в культивировании штамма Streptomyces sp. Г-473 в жидкой питательной среде, содержащей источники азота, углерода, микроэлементы, воду (например, пептон, дрожжевой экстракт, глюкозу и др.) при 28-30^оС, аэрации и перемешивании, в отделении клеток центрифугированием или фильтрацией, в концентрировании и очистке фермента из фильтрата путем ультрафильтрации на мембранах.

Активность фермента определяют по скорости реакции трансформации рифамицина В в рифамицин S (см. примеры). Однако единице активности рифамицинокси- дазы соответствует образование одного микромоля рифамицина S в 1 ч.

Существенными отличиями предлагаемого способа получения фермента являются использование нового штамма продуцента (Streptomyces sp. Г-473), накопление фермента не в мицелии, а в культуральной жидкости, концентрирование и очистка фермента из культуральной жидкости с помощью ультрафильтрации.

Использование нового штамма продуцента рифамициноксидазы, Streptomyces sp. Г-473, и нового способа получения фермента позволяют повысить продуктивность процесса биосинтеза и упростить процесс выделения фермента (за счет исключения стадий разрушения клеток и центрифугирования), что делает возможным промышленное применение способа.

П р и м е р 1. Суспензию спор культуры Streptomyces sp. Г-473, выросшей на агаризованной среде, вносят в колбу Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащую 100 мл посевной среды следующего состава (мас.): глюкоза 1,0; гидролизат казеина 1,0; дрожжевой экстракт 1,0; медь сернокислая 0,005; вода остальное.

Инокулюм выращивают в течение 48 ч при 28^оС на качалке с 220 об/мин и в количестве 10% используют для засева ферментационной среды того же состава (10 колб вместимостью 750 мл, содержащих по 100 мл питательной среды). Культивируют в течение 4 сут при 28^оС на качалке с 220 об/мин. Получают 1 л культуральной жидкости с активностью 12 ед/мл.

Из 1 л культуральной жидкости отделяют мицелий центрифугированием при 3000 об/мин или фильтрацией. Путем ультрафильтрации надосадочную жидкость очищают и концентриpуют до 100 мл. Получают жидкий ферментный концентрат с активностью 120 ед/мл.

П р и м е р 2. Суспензию спор культуры Streptomyces sp. Г-473, выросшей на агаризованной среде, вносят в колбу Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащую 100 мл посевной среды следующего состава (мас.): кукурузный экстракт 2,0; соевая мука 1,0; медь сернокислая 0,005; дрожжевой экстракт 0,5; вода остальное.

Инокулюм выращивают в течение 48 ч при 28-30^оС на качалке с 220 об/мин и в количестве 10% используют для засева ферментационной среды того же состава. Далее аналогично примеру 1 (культивируют при 30^оС).

Получают 1 л культуральной жидкости с активностью 10 ед/мл и 100 мл ферментного концентрата с активностью 100 ед/мл.

Полученный ферментный концентрат используют в реакции трансформации рифамицина В в рифамицин S и по количеству образовавшегося рифамицина S определяют активность фермента. Реакцию трансформации осуществляют в соответствии с условиями примеров 2 и 8 известного способа (патент США 4431735, НКИ 435/119 опубл. 14.02.84).

П р и м е р 3. К 500 мл 0,16% раствора рифамицина В (10 мМ фосфатный буфер с рН 7,8) добавляют 1 мл ферментного концентрата, полученного по примеру 1. Реакцию осуществляют при 37^оС, перемеши- вании и аэрации в течение 8 ч. По окончании реакции осадок рифамицина S отделяют центрифугированием, высушивают над безводным сульфатом натрия. Получают 0,64 г рифамицина S. По количеству образовавшегося рифамицина определяют ферментную активность. Активность фермента составляет 120 ед на 1 мл ферментного концентрата, или 12 ед на 1 мл исходной культуральной жидкости.

П р и м е р 4. Реакцию трансформации осуществляют согласно примеру 3, используя 1 мл ферментного концентрата, полученного по примеру 2. Получают 0,53 г рифамицина S. Активность фермента составляет 100 ед на 1 мл концентрата, или 10 ед на 1 мл исходной культуральной жидкости.

П р и м е р 5. 100 мл ферментного концентрата, полученного по примеру 1, добавляют к 3 л нативного раствора рифамицина В (содержание рифамицина В 8000 мкг/мл), полученного из культуральной жидкости продуцента Nocardia mediterranei Р-84 путем отделения мицелия центри- фугированием. Реакцию ведут при рН 7,8-8,2 в течение 8 ч при перемешивании и аэрации. Реакционную смесь охлаждают до 4^оС, выпавший осадок (рифамицин S) отделяют фильтрацией через стеклянный фильтр и смывают 500 мл ацетона. Ацетон отгоняют. Получают 30,2 г неочищенного препарата рифамицина S. Чистота 74% выход 92% Активность фермента составляет 40 ед на 1 мл концентрата или 4 ед на 1 мл исходной культуральной жидкости.

Некоторые показатели сравниваемых способов дополнительно приводятся в табл.2.

Таким образом, полученные при использовании нового штамма продуцента и способа получения рифамициноксидазы культуральная жидкость и ферментный концентрат обладают повышенной (примерно в 1,6 раза) активностью рифамициноксидазы как в реакции с чистым субстратом, так и в реакции с использованием в качестве субстрата культуральной жидкости продуцента рифамицина В, содержащий помимо рифамицина В еще и ингибиторы фермента.

Использование: биотехнология, конкретно получение рифамицин оксидазы, осуществляющей трансформацию рифамицина B в рифамицин S. Сущность изобретения: изыскание штамма Streptomyces sp Г-473 ВНИИА 2143-продуцента рифамициноксидазы и создание способа получения фермента с использованием штамма Streptomyces sp Г-473, согласно которому выделение фермента ведут из культуральной жидкости концентрированием ультрафильтрацией до достижения активности 120 - 130 ед/мл. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.

1. Штамм Streptomyces sp. ВНИИА 2143-продуцент рифамициноксидазы. 2. Способ получения рифамициноксидазы, предусматривающий культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, микроэлементов и воду при 28 30^oС, перемешивание и аэрацию, отделение мицелия и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Streptomyces sp. ВНИИА 2143, а выделение фермента ведут ультрафильтрацией до достижения активности 120-130 ед/мл.