Способ получения фибринолитического фермента Советский патент 1975 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть применено в медицине.

Известен способ получения протеолитического фермента, обладающего фибринолитической активностью, заключающийся в том, что культуральную жидкость Aspergillys oryzae В 1273 опускают через колонку с анионитом, сырец фермента получают путем осаждения ацетоном, осадок растворяют вводе, осаждают примеси, добавляя соли тяжелых металлов, фильтрат диализируют и лиофилизируют.

С целью получения высокоактивного фермента в качестве продуцента используют культуру Nocardia species щтамм I или культуру Nocardia transvalensis щтамм 19, или культуру Proactinomyces ruber штамм 26.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. В синтетическую среду СР-1 (глюкоза 2%, KNOo 0,1%, К2НР04 0,005%, MgS04 0,05%, NaCl 0,05%, СаСОз 0,1%, FeSOj 10 мкг/л) после стерилизации вносят 5% по объему трехсуточного жидкого посевного материала ;Nocardia species штамм 1, выращенного на среде МПБ с глюкозой. Культивирование проактиномицета осуществляют глубинным способом в колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалках при 30°С в течение 3 суток. По истечении этого времени культуральная жидкость содержит 2081 ед/мл фибринолитического фермента, для выделения которого применяют дробное высаливание сернокислым аммонием. Для этого в культуральную жидкость вносят (NH4)2SO4 в концентрации 0,2 насыщения. Выпавший осадок удаляют фильтрованием, а оставшийся фильтрат донасыщают ()2804 до 08 насыщения и оставляют для более полного высаливания на 24 час при 4°С.

Выпавший осадок, содержащий фибринолитический фермент, растворяют в исходном объеме дистиллированной воды и получают раствор с активностью 1997 ед/мл, что составляет 96% от активности культуральной жидкости. Затем раствор фермента диализуют в течение 24 час нри 4°С против 0,1 М трисбуфера при рН 7,4 с 0,005 М СаСЬ. После диализа активность ферментного раствора составляет до 90% исходной активности, а после лиофильного высушивания раствора получают 950 мг сухого порошка с 1 л культуральной жидкости со специфической фибринолитической активностью, равной 14264 ед/мг белка.

П р и М е р 2. В синтетическую среду Гудзина (глюкоза 2%, глицерин 4%. /-аспарагин 0,5%, Na2HP04 0,4%, КН2Р04 0,3%, 0,1%, натрий лимоннокислый трехзамещенный 0,25%, FeCls 10 мг/л, тиамин 400 мкг/л, биотин 2 мкг/л, пантотеновая кислота 1000 мкг/л)

после стерилизации вносят 5% по объему трехсуточного жидкого посевного материала Nocardia transvalensis штамм 19, выращенного на среде МПБ с глюкозой. Культивирование продуцента осуществляют в течение 3 суток в колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалках при 30°С. По истечении этого времени культуральная жидкость содержит 2239 ед/мл активности. Для выделения фермента используют дробное высаливание сернокислым аммонием с конечным насыщением в 0,8. После растворения осадка фермента получают раствор с содержанием 2059 ед/мл, то есть 92% активности культуральной жидкости. Для удаления низкомолекулярных примесей раствор фермента диализ /ют против трис-буфера рН 7,4 с 0,005 М СоСЬ. После диализа активность ферментного раствора составляет 85% исходной активности, а после лиофильного высушивания с 1 л культуральной жидкости получают 800 мг сухого порошка со специфической фибринолитической активностью, равной 10653 ед/мг ферментного белка.

Предмет изобретения

Способ получения фибринолитического фермента путем выращивания проуцента на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением и очисткой, отличающийся тем, что, с целью получения высокоактивного фермента, в качестве продуцента используют культуру Nocardia species штамм 1 или культуру Nocardia transvalensis штамм 19, или культуру Proactinomyces ruber штамм 26.