Способ получения липосом Советский патент 1985 года по МПК A61K9/50 A61K9/10 

111

5зг.брртеяие относится к медицине п именно г, способу получен 1я липосом

Цел ияобретения упрощение способа ,

Л п и мер KB 10 миллилитровуго rr pivxcoiiyio колбу помешают 2 мл jpJCVTH.TOTforo простого эфира и 1 мл u,wp.O PKc;3Ha затем добавляют 0,2 мл liHcyjniHOBoro раствора 10 мг/л в р.однон 0%-ном NaCC- при рН 3. Затем туд,я /избавляют 150 мг дипальмитоилфосфатидилхолина (гидрофильнолипофил - соединение) и при комнлт :ой температуре гомогенную смесь noABP.prsjciT действию ультразвука в

т-с-чени-- NiHH с помощью генератора BRANSON (г-одель В-12, 20 кГц, 150 Вт), По.чучают прозрачный растг:ор , ее ;,крЛ.а1а;кй липосомные предшестneHHrjft-r Г: г:ид,е мнкропузырьков инсу.niHCBi Fo раствора. Такие микропузырькн г ,/: c:j,;,iipyK)T в коллоидальном Г(;г.гг).-г.:-н1- в органическом растворителе, о/;,рж :Ч/дем избыток раствореннр:; 5 оьерхио1:т -ю активного вещества.

.::. Срг анический раствор пода гг г; ;;,ру. колбу, содержащую 30 мл :,. ;:-; о водного Na(C- концентра;,нк ;,9 /i Si смесь эмульсифицируют ;. ;;-: 3 I. с iiOMoinbio эмульсифицир тоhl:- ; f« uui:;,н, иращающейся с высокой о,-орос г-.;.--. ;осле этой стадии смесь мож; :: г ,1,ер});атъ дисперсию мелких каiii -n/v (р3 -:ического растворителя в

Калсдая капля в дисперсии : олержит описанные липосомные

apejvierл вРН;;ики и избыток липидов.

. г::омп дс.кт трубкл поток возд- -ха ICi.u.asor инутрь колбъ и пропускают :--(е , бл1-1; ко f; гюверхиостр; эмульсии v;.-)H- -v-pr-MeLTT-iBaHHii при 30С; смесь -яоз,г(ука к гтаров растворителя охлажд-,:ог ;- конденсаторе при -IOC, в bVfrie чего пары конденсируются -; (ко::.1ь, Эту оператдао продолжаюг -i;ri тех пор, пока не прекратился кокдеис.Л1,|;ия (примерно 20-30 ) .

.;;i;- этой стадии в колбе остается гфккерно 20 мл прозрачного раствора ( NaC f,).

2 чг липосомиого раствора подвергают хроматографированшо на коионке,, содержащей 2,5 г Сефадекса G-50 (элюент: 0,15 М водный NaCtj Oj,05 М фосфатный буфер, рИ7,5 Ирм анализе (спектрометрнческом) элюта установлено, что только 20-25% перокячального инсулинового раствора

избетает инкаисулир(г. „ Поэтому боль чинстве случаев пплу емиый липсомпмк раствор тсгрччпентическк псполТ)Яонат7- п том , как пи по;.-;ен. бс :ог, г( очистки.

i р и М е 15 2, Водтл-и рлствор и;юглмкози.да1Ь 10 г/л д;1СГ1ергч1рую в 0.15 М растворе NaCt следующим образом. Смесь 7А мг лепитнна, 0,1 .л амилог7гюкозидаз1юго pacTnofia vi 3 мл диизопропилорого зфиря тодпергяют обработке ультразвуком в течсги-; 2 :ип (20 кГц, 1 5Г1 Вт) rip и охлаждении ниже 30 С с помощью охлаждающе : бани. 1олуча:.от прозрачн ую i ом о г е н и у ю т-; ;; i у б о в а г yvi жи.;1 к о с т i X KOTOp-oii доб;и ;|Я;-т 15 мл 0,15 М водного /vaC5 . (месь ,сиг|)Г1ЦИру ог как оггисано в npiiMt pc 1 , поели чего Топкую чмульсиго про;;увают rioтоком азота, который выпаривает оргяническ1-г11 растворитель. Эту проду.жу продо.1г/ка;от до тех пор. пока не прекратится испарение (20-30 мим). Получают прозрачную суспензию кол-ттоидлльных .чппос.ом в вoднo ; О, 15 М растворе лл.Сй , с.одержа 1е -; очень небольшое количество (примери(; 5/0 незахваченпого фермента „

В зависимости от назначения этот раствор можно использоват}) сам гю себе .либо после отделеушя не;;а:;сулированиой ,аг лгл1окозид зы (Hanpiiмер, посредством гель хроматогра1рии на Сефадексе) .

Ирине р 3. Повторяют способ по примеру 1, но ислользуют в качестве и капсулируемого раствора 0,05 1-1 водный 6y(bep:i i;i yjacTBOp (фос фатньш буфер 10 ммол, рН 7,2) 0,5 MF/MJi цитоз1- нарабн1п)зы. Диспергир по1дей фазо1{ являете/ 0,15 М .JaCC (10 1-1:1), -гптидом - кар;и1олипин (i7 мг)5 органическим растворителем - дибутилоный простой зф1-:р (2,4 мл) и СКСе, (0,6 мл) .

Пример , Повторяют способ по примеру 1, но с использованием следую 1(их веществ: инкапсулируемый пеницшшамин концентрации 100 мг/мл (0,1 моль), дисперг11ру1ощая среда водкьй 0,15 М УаСС , поверхностноактивное вещество - лецитин 105 мг, холестерин 35 мг, растворитель бутилацетат 3 мл.

Пример 5. Повторяют способ по примеру 1, но используют следующие ингредиенты: для инкапсулировапил - бетаметлзои концетггршиш 15П мг/л п лодпом динатрнйфосфате (0,05 г-1л) ; диспергирующая фаза водньп 0,15 М А/аС{ ; липи/ - лецитин 85 мг и фосфатидил-этаиоламин /45 мг; растворитель 3-гептанон 3 мл.

Пример 6. Повторяют способ по np№iepy 1 , используя в качестве ингредиентов следующие вещестпп: 0,1 мл подиого раствора кистоткого сомплекса полиииознновой - гюли1и1ти диловой KVicjioT (поли J) - поли (с) концентрации 1 мг/мл - для инкапсулирования j диспергирующая фаза 0,15 М /JaCP поверхностно-активное вещество - лецитин 60 мг, стеариламии 20 мг и холестерин 15 мг, растворитель - смесь 1:1 по объему диизопропилового простого тфира и бутилацетата 3 мл.

Пример 7. К 20 мл д.иизопропилового иростого эфира добавляют 1,5 г лецитина, 0,4 г фосфатидидсерин и 0,5 г холестери15а, затем раствор 1,8 мг актиномицина D в 3 мл фосфатного буфера (0,1 М, рН 7), Смесь по;1вергают ультразвуковой обработке в течение 5 мин, как описан в примере 1, Затем добавляют 100 мл водного фосфатного буфера (0,1 К, рН 7) и дмулгсифицирование осуществляют так же, как в примере; 1. Не останавливая эмульсифициругацей меьчалки, колбу присоединяют к вакуумнгп ловушке и д.авление постепенно умень лают до 10 торр при одновреме)юм поддержании температуры 20-22 С, Поле примерно Д5 мин диизоироиилопьгГ простой эфир полностью отго11яетея. Остаточная смесь получается Б виде проз1)ачного JiiiiiocoMHoro раствора. Псредством хроматографии образца на Се(1)адексе найде ш, что захвачено 88% первоначального акти}юмииинаD .

Пример 8, 1 г трипсина в 30 мл 0,1 М (pil 7 фосфатного буфера обрабатьпчаьэт ультразвуком в присутствии раствора 30 г фосфатидилинозитола в 100 мл дипропилового простого зфира. Затем добавляют 460 л водного 0,5%-ного л/аС и проводят дмульсифицирование. Тонкую эмульсию выпаривaJOT п течение 3 ч дри 15 С под давлением 10 торр, получая в результате прозрачньп липосомный раствор. Посредством аназшза образца (хроматография на Сефадексе G-50

установ.тено, что выход i Hp;ar;cyj; ir.o-панил составляет при 1ерно 85%.

П р и М е р 9, К 3 МП дибутилового простого эфира добавляют 0,1 f-гл водного раствора 3 , 9-бисдиметилами1;офе 1азотио п-1Йхлорида коние)1тра1П{и 0,001 М и 0,15 М лаСС. и 55 мг дипал ьмитоил-фоефат;-1дилхолина. смесь подверг;з}от ультразвуковому

возд,ейств1ш, как описано в примере 1, и получают прозрачный органиче.ски.й раствор, содержащий микропузыр1)Ки (.п1- посомные преддлественники) указанного окрагченного водного .раствора,

окр оя:енные слоем дипальмитоил-фос ф а тид и.Т X о JH-T н а. Ор г а ни ч е с кий р а с т о Р после этого центрифугируют в течетше 20 мин при 8000с,. По окончашги этой стадии получают прозрачн по поверхиостную фазу и полупрозрачную голубую фазу, содержащую микропузырьки. Эту фазу, имеющую консистеннлтю геля, переносят в 10-мил.ииь етроБ1-;; резервуар, где ее перемеии вают с помоп1ью плитгеля с 0,3 мп 200 мг/мл

раствора,(юляpнoe соотношение 20;1) смес1 пгглецитина и фосфатидилсер -; ia в дибути.чором простом Зате к Г .стой массе добав.ляют 5 ;л 0,1 Л по,лного раствора л-аСО и смесь по;1вергают интeнcивнo y 1еремешива ниш магнит ой мешалкой. Через 101 5 мин получают гомоген.ный прозрач1 ый раствор, содержаний в суспензии лштосомы со смеианныьп оболочками. Наружный слой зтой оюлоч и состоит из смеси згглеиит1:на и фосфатидилс грина, а ее вьутренн -;й состоит 1;з дипа-п митоил- фосфатиди.:1хол1;11а .

П р и i е р 10. Липосомнье предшествен1П ки, со.держапще инсутпн, ПОЛУЧГ1ЮТ так же, как описано в приме ре 1. Затем вместо непосредственцо го э yльcифишфoвaния органического

раствора, содержащего микропузырьки в водном 0,9%-ном растворе л/аС(,, органический раствор сначала концентрир 1от, подвергая пониженному давле1-:и:о (20 торр-) при комнатной

температуре. После выпаривани.я органических растворителей на дне резервуара получают маслянистый полупрозрач1Гь:й слой, состоящий из слип шихся микропузырьков. Все это добавляют в колбу с 7 л водного раствора 0,9%-ного и с помощью магнитной мешалки эту маслянист ао фазу диспергир; ют в водной среде.

Эта маслянистая фаза постепенно исчезает и через 10-15 мин получают прозрачный гоьюгеннкй раствор,, содержащий в суспензии нужные липосомы. После хроматографирования этого раствора на Сефадексе 4В (Pharmacia Sweden) анализ некапсулированной фазы показывает, что 52% исходного инсулина эффективно инкапсулировано в липосомах.

Пример 11 о Смесь лецитина 40 г, дибути-аового простого эфира 600 мл и водного 0,9%-ного раствора л/аСг , содержащего 10 г/л инсулина, 400 мл, гомогенизируют с помощью гомогенизатора MIN1SONIC (Ultrasonics Ltd,Great Britain).Получают стабильньй молочнообразный раствор, который наливают в Л-литрову о колбу содержащую 2 л водного 0,9% ного

раствора /VaC , Затем с помощью эмульсифидирующей мешалки органическую суспензию и среду эмульсифицируют вместе 15 мин. После этого органический растворитель удалшот продувкой воздуха, т.е, смесь циркулирует вниз в колонке противоположно

ПОТОКА подппма101це1ч н; я воздуха. Последний собирают, после насыщения парами растворителя, в верхней част колонки. Таким образом получают гомогенный полупрозрачный раствор липосом, содержащих инсулин.

Пример 12, Дибутнловый простой ЭФ11Р 3 мл, водный 9%-ный раствор / АС5-, содержащий 10 мг/мл люулииа, 1 мл и ледитин 125 мг помещают в прочную 1О-миллилитрояую гТирексовую пробирку вместе с 2 г стеклных шаоиков диаметром 1 мм,Пробирку закрь1вают, помещают на мешалку и трясут в течение 30 мин со скоростью 100 об/мин. Таким образом получают довольно гомогенньБ молочнообразны раствор, который вьшивают в Т00-миллшп-1тровую колбу, содержащую 30 Ш1 водного 9%-ного раствора Затем органический растворитель выпаривают, как описано в примере 2, используя поток азота. После продувки в течение 20-30 мин получают липидный раствор липосом, содержа11-тих ;1нкапсулированньм инсулин.

1. СПОСОБ ПОЛ 1ЕНИЯ ЛИПОСОМ, включающий диспергирование инкапсулируемой жидкости в присутствии фос- фо-иипидОБ и раствора поверхностноактивного вещества в вололераствори-мом органическом растворителе с помощью ультразвука и удаление растворителя, о т л и -I а ю щ и и с я . тем, что, с целью упрощения способа, после диспергирования к полученной смеси добавляют воду или водный раствор солей, эмульгируют перемешиванием и удаляют растворитель путем пропускания газй и отгонки или отгонки при пониже1И1ом давлении перед эмульгированием или после него. 2.Способ ио п.15 о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве нерастворимого в воде растворителя используют бензол, алкил- и газоапкилбензолы, а.пифатические зфиры, а.льдегиды, сложные эфиры, кетоны, свободн111е и галогенированные алифатические и циклоалифатические уг л е в од ород ы. 3,Способ по п. 1, о т л и ч а 10 щ и и с я тем, что в качестве липидов используют вещества из группы лецитина,фосфатшдил-этаноламина, лизолецитина. лизофосфат1вдил-этаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, сфингомиэлина, кардиолипи1 а, фосфатной кислоты, цереброзида, стеариламина, дипальмитоилфосфатидилхолина или смеси одного фосфодипида, холестерола и токоферола, 4,Способ попЛ отлнчаю L4 и и с я тем, что в качестве раствора солей используют 0,15 М сл раствор хлорида натрия. 00 5.Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве инкапсо сулируемого вещества используют красители5 ароматические вещества, лекарственные средства, ферменты или полипеитиды.