Способ получения антибиотического комплекса Советский патент 1983 года по МПК C12P1/06 C12R1/465 

;о

4 а

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения антибиотиков. Цель изобретения - получение ан тибиотического комплекса общей фор мулы Й-Бг-ЛН-(0- (Нз dOOKj где , R -C-CH -CHj-), R-j-H антибиотик PS-6; , RI-H, (, - ант биотик PS-7. Указанная цель достигается.тем, что согласно способу получения антибиотического комплекса штамм Streptomyces Л 271 выращивают в пи тательной среде, содерл ащей источники углерода, азота и минеральные .соли, в аэробных условиях при 2037°С и рН 5-9 с последующим выделе нием целевого продукта в виде комп лекса и разделением его на антибио тики PS-6 и PS-7 и/или переводом их в соли, и/или переводом антибио ков PS-6 и PS-7 и/или их солей в с динение, где R-j- низший алкил или группа трифенилметила. Для повышения выхода антибиотика PS-6 в питательную среду в проjuecce культивирования вводят валин и/или лейцин, или Н-валериановую кислоту. Штамм Streptomyces А 271 для по лучения антибиотического комплекса выделен из образца почвы вблизи Эйгеджи Темпль в Йошида Дистрикт в префектуре Фукуи, Япония. Штамм Streptomyces А 271 депони рован под индексом FEPM-P № 3984 в Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Scienc and Tecnnology o Japan, a также под номером АТСС № 31538 в America Type Culture Collection. Морфологические признаки. Разветвленный спорулированный аэральный мицелий, головки аврального ми целия представляют собой крючки, петли или неполные спирали. Овальные или цилиндрические споры образуют цепь из более чем 10,обычно 10-50 спор. Размер О,,01,01,8 мкм, поверхность гладкая. Не наблюдается ни жгутиков, ни спорон гия. На аэральном мицелии образуют ся гифы. Культуральные признаки. Сахарозо-нитратная агаровая среда. Рост обильный, цвет воздушного мицелия ярко-оранжево-желтьМ. Субстратный мицелий ярко-желтый до ярко-оранжево-желтого. Растворимый пигмент отсутствует. Глюкозо-аспарамновая агаровая среда. Рост обильный. Воздушный мицелий светло-оранжево-желтый до ярко-оранжево-желтого. Субстратный мицелий ярко-желтый. Растворимый пигмент отсутствует. Глицерин-аспарагиновая агаровая среда. Рост обильный. Воздушный мицелий светло-оранжево-желтый до ярко-оранжево-желтого , субстратный мицелий бледно-желтый, немного желтовато-гвоздичного цве.та. Растворимого пигмента нет. Агаровая среда с крахмалом. Рост обильный. Воздушный мицелий светлооранжево-желтый до ярко-оранжево- . желтого. Субстратный .мицелий ярко-оранжево-желтый до ярко-желтого. Растворимый пигмент отсутствует. Питательная агаровая среда. Рост обильный. Воздушный мицелий твердо сформированный, если образуется, несколько темный. Субстратный мице-лий светло-желтый. Растворимого пигмента .нет. Агаровая среда с дрожжевым соло- довым экстрактом. Рост обильный. Воздушный мицелий светло-оранжевожелтый до ярко-оранжево-желтого. Субстратный мицелий ярко-Оранжевожелтый до светло-коричневого. Растворимый пигмент отсутствует.. Агаровая среда с овсяной мукой. Рост обильный. Воздушный мицелий светло-оранжевый до ярко-оранжевожелтого, Субстратный-мицелий яркожелтый. Растворимый пигмент отсутствует. Физиологические признаки. Растет при 10-40°С, оптимум роста 20-30с. Желатин сжижает.. Крахмал гидролизует. Молоко паптонизирует, но не коагулирует . Меланоидных пигментов не образует. Хорошо усваивает L-арабинозу, D-ксилозу, D-глюкОзу, L-рамнозу. Слабо усваивает сахарозу. Не усваивает D-фруктозу, инозит, рафинозу, D-маннит, Способ получения антибиотического комплекса осуществляют выращиванием штамма Streptomyces А 271 в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли в аэробных условиях при 20-37°С. Источниками углеводов являются глюкоза, глицерин, мальтоза, сахароза, меласса, декстрин и крахмал, масла и жиры, такие как соевое масло, ореховое масло или лярд. Источниками азота могут быть пептон, солодовый экстракт, соевая мука, масло семян хлопчатника, сухие дрожжи, жидкость от замачивания кукурузы,, дрожжевой экстракт, снятое молоко, казеин, нитрат натрия, нитрат аммония и сульфат аммония. В качестве неорганических солей пр меняют дикамитфосфат, хлористый натрий, карбонат кальция и сульфат магния. При необходимости могут быть добавлены микроэлементы (кобальт и марганец). Для предотвращения вспенивания во время тепловой стерилизации и ферментации могут быть добавлены противовспенивающие агенты, такие как силиконовые или растительные масла. Для увеличения выхода антибиотика PS-6 могут быть добавлены аминокислоты или органические кислоты к питательной среде во время культивации Streptomyces А 271. В качестве аминокислоты могут быть использованы нейтральные аминокисл ты, имеющие 2-10 атомов углерода, в частности валин и лейцин, а в ка честве аминокислоты используют али фатические органические кислоты, имеющие 2-10 атомов углерода, напр .мер Н-валериановую кислоту. Количе во добавляемых аминокислот или орТганических кислот может быть в пре делах 0,01-1% (вес/объем), предпоч тельно 0,1-0,5% (вес/объем). Эти I соединения могут быть добавлены в начале культивации или в интервале до 100 ч от начала культивации. Ами нокислоты или органические кислоты могут быть добавлены одновремен но или раздельно и подаваться чере различные интервалы. Среда до культивации может быть простерилизована. рН среды 5-9. Кул тивирование осуществляют в аэроб нык условиях. Культивацию проводят при перемешивании и/или аэрации. Температурка выращивания 20-40°С, предпочтительно 25-35°С. Ферментацию проводят до тех пор пока не будет получено достаточное количество антибиотиков PS-6 и/или PS-7. Время ферментации обычно составляет 30-90 ч, но оно может меняться в зависимости от состава-сре ды и температуры. Количество антибиотиков PS-6 и/или PS-7 в фермента ционном бульоне может быть определе но с помощью метода биологического испытания и биоаутографии.Так как полученные антибиотики PS-6 и PS-7 в продукте ферментации являются водорастворимыми и главным образом присутствуют в микробных клетках, предпочтительно удалять клетки после процесса ферментации такими методами, как фильтрование, центрифугирование или экстракция и извлекать антибиотики из фильтрата надосадочного слоя или экстракта. Извлечение антибиотиков может быть осуществлено с помощью различных известных процессов. Может быть .использована экстракция при низких рН растворителем, например этилацетатом или Н-бутаном, и обратная экстракция из слоя растворителя в водный слой при более высоких рН, экстракция при нейтральном рН. таким растворителем, как хлористый метилен или хлороформ в присутствии липофильных солей четвертичного аммония, таких как бензалконий хлогрид или тетрабутиламмоний кислого сульфата или циклических соединений, таких как простой эфир дициклогекСИЛ-18-ЦИКЛО-6, простой эфир 15-цикла-5 и обратная экстракция из слоя . растворителя в нейтральный водный слой, содержащий .иодид натрия, иодид калия, адсорбция на активированном угле Амберлите ХАД, Диайон HP-20 и элюирование водным раствором метанола, водным ацетоновым раствором, адсорбция и элюирование с ионообменной смолы, такой как Дауэкс 1x2 или GAE-Сефадекс А-25, iгель-фильтрация с Сефадексом g-10, Био-Гель Р-2, Био-Бидс Q-ХЗ; колоночная, или тонкослойная хроматография с целлюлозой Ависелем 5F, ДЭАЭцеллюлозой. Ватман ДЕ-32, ДЭАЕ-Сефадексом А-25, силикагелем, окисью, „алюминия и осаждение при добавле,НИИ такого растворителя, как ацетон. . Для выделения антибиотика PS-7 из антибиотического комплекса, име|Ющего насыщенную углеродную цепь в серной боковой цепи, в котором могут быть продуцированы и получены одновременно антибиотики PS-5 и PS-6, отделяют их, используя обычную анионообменную хроматографию на смолах, в которой активные компоненты адсорбируются на анионообменной смоле прлистирольного типа, такой как Дауэкс , Ду6литА-101, Амберл11Т 400: .или Диайон РА 306, и антибиотики элюируют водной неорганической солью с последующим элюированием антибиотика PS-7 водным раствором п6лирного растворителя, такого как метанол или ацетон с концентрацией 1-80, предпочтительно 10-75%, содержащего 0,1-10, предпочтительно 1-5% неорганической соли, такой цак хлористый натрий, хлористый калий, хлористый кальций, или бромистый натрий. в зависимости от условий культи:вации в ферментационном бульоне одновременно образуется антибиотик IPS-4 или его соль. Антибиотики PS-4 :и PS-7 продуцируются одновременно и могут быть разделены один от другого с помощью различных методик, например, адсорбируют раствор, содержащий антибиотики PS-4 и PS-7, с помощью адсорбирующей смолы, такой как Диатон HP-20 AG, и элюируют антибиотики с градиентом 0-50%, предпочтительно 0710.% полярного растворителя, растворенного в воде, таког как водный ацетоновый раствор. Антибиотик PS-6 характеризуется следующими физико-химическими и био логическими свойствами. Хроматография на бумаге. Антибиотик PS-6 показывает следующие величины RI при проведении нисходящей хроматографии на бумаге в следующих растворителях: Ацетонитрил Стрис/ЭДтК) Этанол (вода 7/3 Тонкослойная хроматография (ТСХ Для натриевой соли антибиотика PS-6 при проведении тонкослойной хр матографии с использованием пластинчатых хроматограмм 13254 и следующих проявляющих раст орителей получены величины R.J Н-Бутанол/эта. нол/вода (4/1/5) (верхний слой) 0,67 Н-Пропанол/вода (8/2)0,69 Н-Бутанол/изо -пропанол/вода(7/7/6)0,63 Электрофорез на бумаге при высок напряжении Когда антибиотик PS-6 (натриевую соль) подвергают электрофорезу на Тойо фильтровальной бумаги № 50, ви но, что антибиотик мигрирует на рас стояние по крайней мере 5 мм (обычно 10-40 мм) по направлению к аноду при пропускании тока в 30 мин при градиенте 42 В/см в буфе ре (рН 8,6), содержащем 3000 мл воды, 3,3 г барбитала и 25,5 г барбитала натрия. Не проявляет активности по ртнощению к (3-лактамазе Bacillus celreu Антибиотик PS-6 является одноосновной кислотой, имеющей одну карбо сильную группу в молекуле. Характерный максимум УФ-поглощения антибиотика PS-6 (натриевая соль) является следукидим:Ц|| .ЗООн Характерные максимумы поглощения ИК-спектра антибиотика PS-6 (натрие вая соль), измеренного по методике с таблеткой КВг, -4760 (-СОв лактамном цикле); v 1660 (-СО-ами да); i;i600 (-СОО). Молекулярная масса приблизительно 312 (вычислено из результатов г масс-спектрометрии высокого разрешения для метиловогЬ сложного эфира PS-6). Реакция с реагентом Эрлиха положительная. Реакция с иодом-хлорпл тиновбй кислотой положительная, нингидридная реакция отрицательная. Антибиотик PS-6 растворим в воде при рН 6-9, но не растворим в бензоле, ацетоне и этилацетате. Приведенные физико-химические с. свойства четко показывают, что в молекуле антибиотика PS-6 (натриевой соли) имеются группы CHj-CH-; .-™ - - -- -М-NHCOИ .с-оо , о По результатам масс-спектрометрии высокого разрешения для метилового сложного эфира получена следующая молекуляр{1ая формула антибиотика PS-6: C/4H oN204S. Антибиотик PS-6 имеет следующую структуру: ..(ОЙ1з о Биологические свойства антибиотика PS-6. Антибиотик PS-6, обладающий широким спектром антибиотических активностей, проявляет очень высокую активность против различных бактерий, например грамположительных бактерий, принадлежащих к виду Staphylococcus, Diplococcus, Streptococcus и Bacillus.и грамотрицательных бактерий, принадлежащих к видам Aleaiigenes, Cbmamonas. Антибиотик PS-6 также показывает .высокую активность, например, против грамотрицательных бактерий, принадлежащих к виду Kiebsiella, Proteus. Антибиотик PS-6 Проявляет высокую активность против грамотрицательных бактерий, которые являются резистентными к антибиотикам, имеющим р -лактамный цикл в структуре, например, против тех бактерий, которые принадлежат к видам Citrobacter, Proteus, Kiebsiella, Антибиотик PS-6 обладает способностью увеличивать антибиотическую активность других антибиотиков, в особенности -лактамных антибиотиков, таких как пенициллины, цефалоспорины, против таких продуцирующих р -лак тамаз у бактерий, как Pro-, teus yulgaris, Serratia marcescens. Активность in vivo. Антибиотик проявляет высокое терапевтическое действие при введении мышам, зараженным патогенными грамположительными бактериями.. Токсичность. Антибиотик не токсичен при интраперитонеальном введении мышам в дозе 500 мг/кг. Антибиотики PS-7. . Физико-химические свойства антибиотика PS-7. Хроматография на бумаге. Антибиотик PS-7 (натриевая сол показывает следующие величины Ri при нисходящей хроматографии на бу маге с использованием Тойо фильтро вальной бумаги №50 на следующих системах растворителей: Ацетонит-;; рил/трис/ЭДТК Этанол/вода Тонкослойная хроматография (ТСХ Антибиотик PS-7 (натриевая соль показывает следующие величины R/ при тонкослойной хроматографии на хроматографической пластине 13254 из целлюлозы со следующими системами растворителей: Н-Бутанол/этанол/вода (4/1/5) (верхний слой) Н-Пропанол/вода н-Бутан6л/изопропанол/водаС7/7/6) Ацетонитрил/вода (8/2) Электрофорез высокого напряжения на бумаге. Антибиотик PS-7 (натриевая соль при электрофорезе на Тойо фильтровальной бумаге № 50 с использованием аппаратуры для электрофореза на бумаге при высоком напряжени мигрирует к аноду по крайней мере на -5 мм (обычно в интервале 1040 мм) в буферном растворе, содержащем 3,3 г барбитала, 25,5 г барб тала.натрия и 3000 мЛ воды (рН 8,6 при пропускании тока 42 В/см в течение 30 мин. Антибиотик iS-7 является неакти ным к р-лактамазе из Bacillus cere Антибиотик PS-7 является одноос новной кислотой, содержащей одну карбоксильную группу. УФ-спектр поглощения антибиотика PS-7 {натриевой соли) имеет сле дующие характеристики (максимумы поглощения): Я 220 нм и | .. а ИК-спектр поглощения антибиотика PS-7 (натриевой соли), измеренный .в таблетке с КВг, имеет характеристические максимумы поглощения со следующими волновыми, числами,. см : (-CO-R-лактамного цикла); 4670 (-СО-амида); «-1620 (СО .и ), Молекулярная масса приблизительно 296 (вычислено из результатов масс-спектрометрии высокого разрешения для метилового эфира антибиотика PS-7). Реакция с реактивом Эрлиха положительная. Реакция с иод-хлорплатинатом положительная. . Реакция с нингидрином отрицательная. Легко растворим в воде при рН 9, практически нерастворим в бензоле, ацетоне и этиладетате. Физико-химические свойства приводят к утверждению, что антибиотик PS-7 (натриевая соль) имеет группы СН -СНо-; СНоСО-; 5f V-T . -СН- lr /-NHCO- и -С00 в мо;п -плекуле. Антибиотик PS-7 является соединением со следующей структурной формулой: CHj-CHi.-.; -clH« lH-i H- f odH, oJ-к- Соон Биологические свойства антибиотика PS-7. Антибиотик PS-7 обладает широким спектром антимикробной активности. Он показывает очень высокую антимикробную активность на различных микроорганизмах, например грамположительных бактериях, принадлежащих к виду Staphylococcus или к виду Diplococcus, а также высокую антимикробную активность,по отношению к грамотрицательным бактериям, принадлежащим, например, к виду Alcaligenes. Антибиотик характеризуется своей высокой антимикробной активностью по отношению к грамотрицательным бактериям, принадлежащим, например, к виду Citrobacter или к виду Enterobacter, которые являются резистентными к известным |)-лактамым антибиотикам. Антибиотик PS-7 обладает способностью увеличивать антимикробную активность других антибиотиков, например р -лак тамных антибиотиков, таких как цефалоспорины, по отношению к бактериям, продуцирующим (i-лактамазу, таким как Proteus vulgaris или Serratia marcescens. Активность . Антибиотик оказывает значительное терапевтическое действие при введении мышам, зараженным патогенными грамположительными бактериями. Антибиотик не показывает острой токсичности при интраперитонеальном введении; мышам при дозе 500 мг/кг. Антибиотики Р§.-з6 и PS-7 явлйются стабильньгмц В:.;солевой ФормеVСолевэ,я. .ф9@мй. включает, например, соли щелочных металлов, как натриевую соль, калиевую -соль или литиевую соль. -.соли щёлочноземельных металлов, такие как кал циевая или магниевая соль, соли др гих металлов, такие как алюминиевая, аммиачная, соли первичных, в ричных или третичных аминов, как моноэтиламин, диметиламин, триэтил амин, моноэтаноламин- или диэтилоламин, и соли органических основан такие как бензатин или прокаин. Пригодными солями являются также соли щелочных металлов, такие как натриевая или калиевая соли. Антибиотики PS-6 ч PS-7 являют ся одноосновными кислотами, имеющими одну карбоксильную группу и лекуле. С помощью различных спиртов меркаптанов или их производных из антибиотиков Могут быть по лучены различные сложные эфиры. Подходящими сложными эфирами антибиотиков PS-6 и PS-7 являются те из них, которые отвечают следу ющей структурной формуле . i .- -Вг-КН-еО-С Н pj-Ж еоОКз1 где низшая алкильная группа или трифенилметильная группа. Ё формуле низшая алкильная груп па может быть группой с прямой или разветвленной цепью, в частности группой, имеющей 6 или менее атомов углерода, или группой, -имеющей 1-4 атома углерода. Примерами является метил, этил, н -пропил, изопропил, н -бутил, -бутил, Н-пентил, t/зо -пентил и Н-гексил. Сложные эфиры приведенной формулы могут быть получены при взаи модействии антибиотика PS-6 или PS-7 или их солей с соединениями о щей формулы . где V - атом или группа, которая может быть отщеплена, или с низшими диазоалканами.Представителями соединения этой формулы являются метиловьй спирт, йодистый метил, димётилсульфонат, метилмеркаптан, хлористый Ц-пропи йодистый ff-пропил, пропиловый спи ИЗо-пропиловый спирт, бромистый изопропил, йодистый изопроил, н-бу тиловый спирт, бромистый н-бутил, йодистый н-бутил, м -пентиловый спи хлористый н -пентил, бромистый Н-пентил, йодистый н-пентил-; 1-Н 5 ё1 ёй#1о-. вый спирт, бррмийт.ый:Н:.-л1 екейл, йодистый Н-гексил, тритИловый спир±, тритилмеркаптан, тритилхлорид и тритилбромид.: :. Реакцию антибиотика PS-6 или PS-7 с соединениями формулы или с низшим диазоалканом можно проводить известными методами: этерификации без реакционной среды, но обычно ее проводят в инертной жидкой среде. , Инертные жидкие среды включают, например, такие углеводородй,, как бензол, толуол,к -гексан или цикло- . гексан, галоидированные углеводороды, такие как хлороформ или хлорис-, тый метилен, амиды, такие как диметилформамид или гексамётилфосфоротриамид, диметилсульфоксид, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир, диизопропиловый эфир, АИ -Н-бутиловый эфир, тетрагидрофуран или диоксан, сложные эфиры, такие как этилацетат или Н-бутилацетат, кетоны, такие как ацетон или метилэтилкетон.Температура реакции может меняться в широких пределах в зависимости от вида соединения и вида жидкой инертной среды, однако не должна превышать 60°С (предпочтительно 0-40°С). При необходимости в реакции может быть использован промотор, такой как триметиламин, триэтиламин, пиридин или дициклогексилкарбодиимид. - В этих условиях реакция может быть закончена за 1-24 ч,обычно за 3-12 ч. Антибиотики PS-6 или PS-7, которые -должны быть .введены в реакцию, необязательно выделять в виде самого продукта. Можно также использовать и сырой антибиотик PS-6 или PS-7, полученный путем частичной очистки продукта культивации. Примером таких частично очищенных продуктов является концентрированный элюат из активированного угля и концентрированный элюат ид Диайон НР-20, которыми обрабатывают отфильтрованный бульон, обессоленный концентрат элюата с активированного угля, полученного с градиентом концентрации хлористого натрия в фосфатном буфере из САЕ-Сефадекс, на котором адсорбирован концентрированный элюат из Диайон НР-20, концентрированный метиленхлоридный экстракт в присутствии бензалконийхло$ ида, хлороформный концентрированный экстракт и бутанольный концентриро ванный экстракт при рН 3,5 при низ- . кой температуре. Полученные таким образом антибиотики PS-6 или PS-7 могут быть выделены из реакционной смеси или очивдены известными способами. После завершения реакции-реакционную см сначала выливают в водную среду д удаления водорастворимых примесей таких .как побочные продукты. Пред почтительно используют нейтральны буфер в качестве водной среды для сохранения нейтрального рН. Сложный эфир антибиотика PS-6 или PSв этой смеси экстрагируют затем менее полярным органическим раст|Ворителем, который по существу не смешивается с водой, таким как эти ацетат, бензол или хлороформ. Мож но добавлять хлористый натрий или сульфат аммония. После сушки над безводным сульф том натрия сложный эфир выделяют из слоя растворителя известными способами, например гель-фильтраци ей, используя Био-Биидс S-Хз или Сефадекс LHr-20, или адсорбционной хроматографией, используя такой но ситель, как силикагель, окись алюминия или флоросил. Очищенный таким образом сложный эфир очищают перекристаллизацией из такого растворителя, как бензол, толуол, ксилол, этилацетат, диэтиловый эфир, хлористый метилен хлороформ, гексан и петролейный эфир. Среди сложных эфиров тритиловый эфир антибиотика PS-6 или PS-7 является более стабильным, чем антибиотик PS-6 или PS-7, и обладаетболее высокой антибактериальной ак тивностью и активностью по ингибированию -лактамазы. Физико-химические и биологические свойства тритилового эфира антибиотиков PS-6 и PS-7. Физико-химические свойства трит лового эфира антибиотика PS-6. УФ-спектр поглощения ;i J°( 315 ,0 нм. Цветные реакции. Реакция с реагентом Эрлиха положительная. Реакция с иодом-хлорплатиновой кислотой положительная. Реакция с нингидрином отрицател ная . Тонкослойная роматография (ТСХ Получены следующие величины R| на пластинах со следующими растворителями при тех сложного эфира; ДС-Фертигплаттен Кизельгель 60 F Бензол/ацетон (2/1) Бензол/этилацетат (1/8) Биологические свойства тритилоэ го эфира антибиотика PS-6. Антимикробный, спектр. Тритиловый эфир антибиотика PSобладает широким антибимикробным спектром и проявляет высокую активность против различных бактерий, например грамположительных бактерий, принадлежащих к виду Staphyiococcus, Dipiococcus и Streptococcus; и грамотрицательных бактерий., принадлежащий к виду Alcaligenes. Тритиловый эфир антибиотика PS-6 также проявляет хорошую активность против грамотрицательных бактерий, принадлежащих к виду Klebsieiia, Proteus. Тритиловый эфир антибиотика PS-6 проявляет высокую активность против грамотрицательных бактерий, которые являются резистентными к антибиотикам, имеющим в своей структуреР лактамный цикл, например, против бактерий видов Citrobacter Proteus Klebsieiia и Serratia. Активность in vivo. Тритиловый эфир антибиотика PS-6 проявляет терапевтический эффект при введении мышам, зараженным грамположительными патогенными бактериями. Токсичность. .-.Тритиловый ЭФ-ИР не токсичен при интраперитонеальном введении мышам в дозе 500 мг/кг. Тритиловый эфир антибиотика PS-7. Физико-химические свойства тритилового эфира антибиотика PS-7. УФ-спектр поглощения я 321,0 нм 230,5 нм. Цветные реакции. Реакция с реагентом Эрлиха положительная. Реакция с иодом-хлорплатиновой кислотой положительная. Нингидринная реакцид отрицательная. Тонкослойная хроматография (ТСХ). ДС-Фертигплаттен Кизельгель 60 Fj.o - . R, Бензол-ацетрн (2/1) Бензол-этилацетат (1/8) Биологические свойства тритиловОго эфира антибиотика PS-7. Антимикробный спектр. Тритиловый эфир антибиотика PS-7 обладает широким антимикробным спектром и проявляет очень высокую активность по отношению к различным бактериям, например грамположительньом бактериям, принадлежащим к видам Staphyiococcus, Diplococcus и Streptococcus, и грамотрицательным бактериям, принадлежащим к видуЛ1са11genes. -. Тритиловый эфир антибиотика PS-7 также показывает хорошую активность Против, например, грамотрицательых бактерий, принадлежащих к видам Klebsieiia и Proteus. Тритиловьг й эфир антибиотика PSпроявляет высокую активность против грамотрицательных бактерий, которые являются резистентными по отношению к антибиотикам, имеющим -лактамный цикл в своей структура например, по отношению к Citrobact Proteus, KlebsieJla и Serratia. Активность in vivo. Тритиловый эфир антибиотика PSпроявляет высокое терапевтическое действие при введении мышам, зараженным патогенными грамположител ными бактериями. Токсичность. Тритиловый эфир не проявляет острой токсичности при интраперито неальном введении мышам в дозе 500 мг/кг. Тритиловые эфиры антибиотиков PS-6 и PS-7 и сами антибиотики проявляют высокие антимикробные ак тивности и могут быть эффективно использованы для профилактики и те рапии бактериальных инфекций, встр чающихся не только у людей, но так же и у животных, например млекопитающих, у домашней птицы и рыб. Кроме того, Тритиловый эфир является- очень важным в качестве промежуточного продукта для синтез других фармацевтических препаратов, потому что тритиловая группа в тритиловом эфире является очень активной и легко отщепляется. Антибиотики PS-6 и PS-7 или их трйтиловые эфиры могут быть введены орально, местно или парентераль но (внутривенно, внутримышечно, .интраперитонеально и т.п.) и могут быть использованы в одном из обычных фармацевтических препарато в зависимости от пути введения. На пример., антибиотик PS-6 тр тиловый эфир может быть приготовле с фармацевтически приемлемым носите лем или разбавителем в твёрдых фор мах (например, в виде таблеток, ка сул, порошков, гранул, таблеток, покрытых сахаром, порошков для рас пыливания, свечей), полутвердых формах (например, мази, кремы, пол твердые капсулы) или жидких формах (например, жидкие растворы, эмульсии, суспензии, лосьоны, сиропы, растворы для инъекций, жидкие составы для распыления). Единица дозы препарата, содержа щего антибиотик PS-6 или его тритиловый эфир, может содержать 0,199 вес.. %, (предпочтительно 10-60) активного компонента в любой форме: жидкой, полутвердой или твердой . Таблетки и капсулы для орального введения могут быть в виде пр паративной единицы дозы и могут со держать связующие агенты, например сироп, камедь, желатин, сорбит, трагекант или поливинилпирролидон; наполнители, такие как лактоза, сахароза, крахмал, фосфат кальция, сорбит или глицин, смазки, такие как стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль, или окись кремния, дезинтеграторы, например картофельный крахмал; или смачивающие агенты такие как натрийлаурилсульфат. Таблетки могут быть покрыты известными СП-особами. Жидкие препараты для орального применения могут быть в виде масляных или водных суспензий, растворов, эмульсий, сиропов или могут быть выпущены как сухие продукты, подлежащие смешиванию.с водой или другими подходящими носителями при использовании. Жидкие препараты для орального использования могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные добавки, такие как, например, суспендирующие агенты, например метилцеллюлозу, сироп сорбита, сахарный ироп, оксиэтилцеллюлозу, желатин, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия, гидрированные съедобные жиры и масла; эмульгирующие агенты, например камедь, лецитин, моноолеат сорбита; неводные носители, например этиловый спирт, пропиленгликоль, сложные.эфиры масел, фракционированное кокосовое масло, миндальное масло; и консерванты, например метил-П-оксибензоат, пропил-П-оксибензоат, сорбитовая кислота. Свечи могут содержать основы для свечей, подобные кокосовому мае лу и различным глицеридам. Составы для инъекций могут быть приготовлены в виде единиц дозы в ампулах или водных носителях, и в случае необходимости они могут содержать формулирующие агенты: суспендирующие, диспергирующие и стабилизирующие. Антибиотик может быть приготовлен в виде порошка, способного быть восстановленным в свободной от пирогенов стерильной воде перед использованием. Составы, содержащие антибиотик PS-6 или PS-7 и/иЛи трйтиловые эфиры антибиотиков PS-6 или PS-7, могут быть приготовлены в различных формах, подходящих для абсорбции через слизистые оболочки носа, горла и бронхи, например в форме порошка или распыливаемой жидкости, ингаляционных препаратов, таблеток, горловых смазок. Для лечения ушей и глаз антибиотики могут быть приготовлены в виде индивидуальных капсул, в виде капель, в жидкой или полутвердой форме; мо,гут быть представлены также в виде.

рецептур в гидрофильных или гидрофобных основаниях, таких как порошки, лосьоны, кремы или мази.

В дополнение к носителю составы могут содержать другие ингредиенты, например консерванты, антиоксиданты, смазки, агенты, влияющие на вязкость, отдушивающие агенты, суспендирующие агенты, связующие и стабилизирующие агенты.

Антибиотик PS-6 или PS-7 и/или . их тритиловые сложные эфиры, пред-назначенные для использования в ветеринарии, например, для лечения инфекции у свиней, коров, овец, кур, могут представлять собой внутригрудные рецептуры в основаниях ; продолжительного действия или быстро высвобождающих основаниях или в виде концентратов для пищевых добавок .

Фармацевтические составы могут содержать антибиотик PS-6 или PS-7 Си/или их тритиловые эфиры) в качестве единственного активного ингредиента или в сочетании с другими терапевтическими эффективными

ингредиентами.

.1 .

: Так как антибиотик PS-6 или PS-7 и их тритиловые сложные эфиры обладают синергетическим действием на различные бактерии, продуциру-. ющие р -лактамазу в сочетании с лактамными соединениями, их объединяют с (-лактамными соединениями в фармацевтических составах, В качестве -лактамных соединений могут быть использованы производные пенициллина, такие как бензилпенициллий, феноксиметилпенициллин, карбенициллин, амплициллин и амоксициллин; и производные цефалоспорина, такие как цефалоридин, цефалотин, цефааолин, цефалёксин, цефоксйтин, цефастрил, цефамандол, цефапирин, цефрадин и цефалоглицин.

Антибиотик PS-6 или PS-7 и/или их тритиловые сложные эфиры сочетают с одним или несколькими представителями -лактамных соединений. Желательно использовать количественное соотношение антибиотика к известному р-лактамному соединению (иям) в интервале от 20:1 до 1:150, предпочтительно от 10:1 до 1:100.

При лечении бактериальных инфекций у людей доза антибиотика PS-6 или PS-7 и/или их тритилового сложного эфира может меняться в зависимости от объекта, подлежащего лечению, веса тела, типа, -тяжести и симптомов инфекции, способа и числа приемов лекарства. Для обычного орального или парентерального введения удобно использовать дневную дозу в интервале 0,05-500 мг/кг, предпочтительно 0,5-200 мг/кг при дробной дозировке.

Антибиотик PS-6 или PS-7 и/или их тритиловые сложные эфиры могут :-быть использованы в фармацевтических составах или могут быть добавлены непосредственно или в виде 5 концентрированных пищевых добавок в пищу животным. Кроме того, они могут быть использованы в качестве ,ингредиентов для пищевых консерван. тов или дезинфицирующих средств. 0 Пример. Стерилизуют при 2О®С в течение 15 мин 500 мл колбу Эрленмейера, содержащую посевную культуральную среду (SE-4). К хорошо спорулированной скошенной культуре Streptomyces sp. А 271 приливают 10 мл 0,02%-ного раствора Твин-80 (поверхностно активный агент) и слегка перемешивают для получения суспензии спор. Инокулируют 1 мл суспензии спор в колбу Эрленмейера 0 емкостью 500 мл и культивируют при встряхивании при в течение 48 ч на вращающемся встряхивателе (200 об/мин, радиус цикла 3,5 см). Затем 2 мл посевной культуры иноку5 лируфт в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащую 100 мл следующей производящей среды и культивируют при встряхивании в течение 48-96 ч при 28°С на вращающемся встряхиваю0щем устройстве.

Посевная культураль.ная среда.(SE-4) вес/объем

Экстракт говядины, %0,3

5. Бакто-триптон,% 0,5 Глюкоза, % 0,1 Растворимый

крахмал, %2,4

Дрожжевой экстракт, %0,5

0 Карбонат кальция, % 0,4 Обезжиренная

соевая мука, %0,5

рН перед сте5рилизацией7,5

Производящая среда

AG-1 среда

вес/объем

0

1,5

Глюкоза, % Кукурузный крахмал, %

2,5 Жидкость от замачивания куку5рузы, %

2,0

1,0 Сухие дрожжи,% fl,L-MeTHOHHH, %

ОД CoCl26H20, %

0,00013 рН перед стери0

7,2 лизацией

АСА-2 среда

вес/объемГлюкоза, % 1,5 Картофельный

2,5 .крахмал, %

5 Жидкость от замачивания куку2,0 рузы, % 1,0 Сухие дрожжи, % 0,00 CoCli- 6HgO, % AGB среда вес/об 3,0 Мальтоза, % Жидкость от замачивания кукурузы, % 1,0 Сухие дрожжи, % CoCl2 , % 0,00 рН перед стерилизациейвес/об AGB-41 среда Мальтоза, % 5,0 Растворимый крах 1,0 мал , % Глицерин, % 0,3 Сухие дрожжи, % 2,5 0,5 NaCi, % ,% 0,05 MgS04., % 0,05 СаСО-, % 0,3 .CoCl eHjO, % 0,00 рН перед стерилизациейвес/об ML-19 среда 4,0 Глицерин, % 0,5 Пептон, % Глюкоза, % 0,2 Картофельный крахмал , % Обезжиренная соевая мука, % Сухие дрожжи, % NaCl, % СаСО , % вес/об AGO-1 среда Соевое масло, % Сухие дрожжи, % NaCl, % , % MgS04-7Н О, % CaCO-:i, % 0,00 , % 7,0 рН перед стерилизациейНебольшое количество культура ного бульона берут из каждой кол для пробы через регулярные проме жутки времени. Активные компонен в образцах экстрагируют, концент рируют и определяют наличие анти отиков PS-6 и PS-7 с помощью хром графии на бумаге и биоаутографии Определение антибиотика PS-6 Элюируют 10 мл надосадочной ж кости отцентрифугированного куль рального бульона в миниколонке, держащей 1,5 мл Диайон НР-20. По абсорбции активного компонента его элюируют водным ацетоновым р вором,(50% объем/объем). Вначале отбрасывают О,5 мл элюата, а 2 мл последующего элюата собирают. Элюат концентрируют и 20 мл концентрированного элюата подвергают нисходящей хроматографии на бумаге, используя фильтровальную бумагу, проявляя при 5°С в течение 7-20 ч в растворителях различных видов. После проявления еще влажную фильтровальную бумагу прикрепляют к пластине для проведения испытаний и для биоаутографии, используя различные виды микроорганизмов, на 15-30 мин. Затем удаляют фильтровальную бумагу, а пластину для испытаний культивируют при 30°С в течение 18 ч. .Образец, включающий антибиотик PS-6, образует зону ингибирования при положении R антибиотика PS-6. Определяют антибиотик PS-6 В культуральных бульонах шести описанных сред. Определение антибиотика PS-7. Порцию 10 мл надосадочного слоя, полученного центрифугированием культурального бульона, помещают в миниколонку с 1,5 мл Диайона РА-ЗОб. Колонку промывают О,5.мл 5%-ного (вес/объем) раствора хлористого натрия и элюируют 50%-ным (вес/объем) метанольным водным раствором, содержащим 3% (вес/объем) хлористого натрия. Отбрасывают первый 1,0 мл элюата и последующие 5,0 мл элюата собирают. После выпаривания при пониженном давлении для удаленияметанола элюат. помещают в миниколонку с 1,5 мл Диайон НР-20. Активный компонент, адсорбированный смолой, элюируют 50%-ным (объем/объем) ацетоновым раствором. Первые -0,5 мл элюата отбрасывают, а последующие 2,0 мл элюата собирают., Элюат концентрируют и 20 мл полученного концентрата капают в виде пятна на Тойо фильтровальную бумагу № 50. Проводят нисходящую хроматографию на бумаге с различными системами растворителей при 5°С в течение 7-20 ч. . После проявления наполовину высушенные эроматограммы контактируют в течение 15-30 мин с агаровой поверхностью пластин для испытаний для биоутографии,, содержащей различные испытуемые микроогранизмы. Пластины для испытаний инкубируют при 35®С в течение 18 ч. Образец, содержащий антибиотик PS-7 дает рост зоны ингибирования при положении величины антибиотика PS-7. Результаты показывают что антибиотик PS-7 определен во всех фильтратах бульонов, полученных при использовании упомянутых выше четырех видах сред, хотя их накопленные количества отличались одно от другого. Пример 2. Культивируют Streptomyces А271 по методике при1мера 1 с тем исключением, что используют ранее упомянутую сред AGB-42. За 24 ч до начала и чере 24 ч после начала культивации к де прибавляют 0,2% ДЬ-валина или L-валина. Количество антибиотика PS-6, накопленного в культуральном бульоне после встряхивания к туры в течение 72 ч, в четыре ра больше, чем в контрольном культу ральном бульоне, куда валин не п бавляли.. Состав среды (AGB-42) - вес/об Мальтоза, % Растворимый 1,0 крахмал, % 0,3 Глицерин, % 3,0 Сухие дрожжи, NaCl, % 0,5 К2НР04, % 0,5 0,5 MgS04-ТН О, .% СаСОа, % 0,3 , % 0,00 рН перед стерилизациейПример 3. Культивируют Streptomyces sp.A271 по методике примера 1 с тем исклк), что пользуют среду ML-19, описанную в ше. За 24 ч до начала и через 24 после начала культивации к среде прибавляют 0,2% ДЬ-валина или L-в лина. После 72 ч культивирования при встряхивании количество антиб тика PS-6, накопившегося в бульон в четыре раза больше, чем в контрольном бульоне, где валин был ис ключен. ; Пример 4. Культивируют Streptomyces sp. А271 по методике примера 3, но с тем исключением, что прибавляют ДЬ-лейЦИн Или L-ле цин вместо ДЬ- или L-валина. После 72 ч встряхивания культуры количество антибиотика PS-6, накопи шегося в бульоне, в два раза боль ше, чем.в культуральном бульоне, из которого лейцин исключен. Приме р 5. Культивируют Streptomyces sp,A271 по методике примера 1 с тем исключением, что Используют среду AGB-3. Перед куль тивациейк среде прибавляют 0,1% L-валина и 0,3% L-лейцина. После 72 ч культивирования при встряхив НИИ в.бульоне накапливается значительное количество антибиотика PS-6. Состав среды (AGB-3) вес/объ Мальтоза, % сухие дрожжи, NaCl,% К2НР04 , % MgSp4-7H20, % , %0,3 eHjO, % ; 0,00013 рН перед сте. рилизацией7,0 П р и м е р 6. Проводят культивирование по методике примера 2, но прибавляют Н-валериановую кислоту вместо ДL- или L-валина. Количестщо антибиотика PS-6, накоплен ного в бульоне при культивировании со встряхиванием за 72 ч, i в четыре раза превышает его количество в контрольном бульоне без добавленияН-валериановой кислоты. Пример 7. По методике примера 3 проводят культивирование, но вместо ДL- или L-валина добавляют Н-валериановую кислоты. Количество антибиотика. PS-6, накопленного в бульоне, в два раза больше, чем в контрольном бульоне, в который не добавляли н-валериановую кислоту. Пример 8. Проводят культивацию по методике примера 5., но вместо L-валина добавляют н-валериановую кислоту. Количество антибиотика PS-6, накопленного в бульоне, в четыре раза больше, чем в контрольном бульоне, из которого исключена. Н-валериановая кислота. Пример 9. Помещают 100 мл посевной культуры, приготовленной, как описано в примере 1, в ферментер емкостью 30 л, содержащий :15 л SE-4-среды, и проводят культивирование при усиленной аэрации при 28®С в течение 24 ч при 200 об/мин. Подача стерильного воздуха составляет 7,5 л/ч. Инокулируют 1 л среды в 100 л среды AGB-42 (перед инокулированием добавляют 0,5% L-валина) в стальной ферментер емкостью 200 л, проводят культив.ацию при усиленной аэрации при 50 Л/мин при 28°С в течение 72 ч при 100 об/мин. Антибиотическая мощность oтцeнtpифyгиpoвaннoгo надосаДочного слоя бульона составляет 450 ССЕ/мл. К бульону прибавляют 3% (вес/объем) перлитового фильтрукщего вспомогательного средства и фильтруют через фильтр-пресс, получая при этом 60 л фильтрата (общая антибиотическая активность 25,5-10б ССЕ). Все последующие операции проводят в условиях охлаждения до 6®С. Фильтрат адсорбируют на колонке, набитой 6л ионообменной смолы, Диайон РА-306. Колонку элюируют 20 л 5%-ного (вес/объем) раствора хлористого натрия, чтобы получить активную фракцию (А), содержащую антибиотики PS-5 и PS-6 (общая антибиотическая активность 4,2 ). Колонку после элюирования применяют для выделения антибиотика Р8-7. Активную фракцию (А) загружают в коло.нку со смолой Диайон НР-20 ( см), после чего элюируют,с 10%-ным водным раствором ацетона. Элюат концентрируют при пониженном давлении., чтобы отгонять ацетон, и пропускают через колонку с QAE-Сефадекс, предварительно уравновешенную до рН 8,0 1/100 фосфатным буферным раствором, проводят элюирование с линейным градиентом концентрации хлористого натрия в М/100 фосфатном буферном растворе с концентрацией NaCl 1-0,4 М, элюат собирают фракциями по 10 г. СобранНые фракции разбавляют в 100 раз и собирают активные фракции после определения УФ-спектра поглощения и биоиспытания. Чтобы полностью удалить содержащийся в них .антибиотик PS-5 активную фракцию пропускают через колонку с Диайоном НР-20 Л и элюируют 300 мл водного раствора метанола с линейным градиентом концентрации метанола 10-75%. Объем каждой фракции равен 4 г. Каждую фракцию подвергают нисходящей хроматографии на бумаге, проявляют смешанным растворителем, состоящим из 120 мл ацетонитрила, 30 мл (1/10 М Трис/оксиметил -аминометан-HCi буферного раствора (рН 7,5) и 1 мл 1/10 -М водного раствора этилендиаминтетраацетата натрия (рН 7,5) и анализируют путем биоаутографии. Активные фракции с № 25 - 30, .содержащие антибиотик PS-5, и активные фракции № 33 - 40, содержащие антибиотик PS-6, собирают-. Концентрируют активную фракцию, содержащую антибиотик PS-6, и после отгонки метанола сушат- вымораживанием. Полученный таким образом лиофилизированный препарат растворйют в 1 мл М/100 фосфатного буферного раствора (рН 8,0) и затем загружают для очистки в колонку (1,280 см) с Сефадексом G-10 и проявляют тем же буферным раствором. Собирают активные фракции и устанавливают рН 8,3 разбавленным водным раствором гидроокиси натрия, а затем загружают в колонку (1,220 см) с Диайоном НР-20. Проводят элюирование 10%-ным водным ацетоновым раствором для обессоливания. Собирают активную фракцию и сушатвымораживанием для получения 2,4 мг белого лиофилизированного препарата антибиотика PS-6 в виде натриевой соли. Колонку с Диайон , которую элюируют раствором хлористого натрия и хранят для выделения антибиотика PS-7, элюируют 50%-ным (объем/объем) водным метанолом, содержащим 3% (вес/объем) хлористого натрия, чтобы получить активную фракцию (В) (общая антимикробная активность 1,1-10 ОСЕ, выход 4,3%)

Элюат активной фракции (В) осле концентрирования при пониженном давлении для удаления метанола адсорбируют «а колонке (370 см), набитой Диайон НР-20 и элюируют 10%-ным (объем/объем) водным ацетоном. Элюат фракционируют на порции по 25 г в каждой.

Объединяют активные фракции и концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетона. Концентрат адсорбируют на колонке (2, см) с QAE-Сефадексом, предварительно выдержанной в буферном растворе k/lOOO фосфатного буфера

с рН 8,0, и элюируют хлористым натрием с линейным градиентом концентрации 0,1 - 0,7 М в М/100 фосфатном буфере. Элюат фракционируют на порции по 17 г каждая. Каждую фракцию анализируют биоиспытанием и хроматографией на бумаге с последующей биоаутографией и собирают фракции № 25 - 33, объединяют их, в них содержится антибиотик PS-7.

Указанную выше активную адсорбируют на колонке (1,1/20 см), набитой Диайон НР-20 ЛС, и элюируют ацетоном с линейным градиентом концентрации 0-10% при общем объеме

400 мл. Элюат фракционируют на порции по 5 г в каждойi Каждую фракцию разбавляют в 50 раз для УФ-анализа. Собирают фракции № 15 - 20, в которых содержится антибиотик

лиофилизируют, получить сырой препарат антибиотика PS-7.

Для дальнейшей очистки антибиотика PS-7 полученный таким образом лиофилизированный сырой препарат антибиотика PS-7 растворяют в М/100 фосфатном буферном растворе с рН 8,0 и загружают в колонку (1,21 80 см) заполненную Сефадекс G10, а затем . проявляют тем же буферным раствором.

Активные фракции объединяют и адсорбируют на колонке (1,1-20 см), заполненной QAE-Сефадекс и предварительно выдержанной в буферном растворе М/100 фосфатного буфера с рН

8,0, затем элюируют хлористым натрием при линейном градиенте концентрации О - 0,4 М при общем объеи1е 200 мл. Объединяют активные фракции с колонки. К фракции прибавляют натрий с концентрацией 3% (вес/ ,Ьбъем). Раствор адсорбируют на колонке (1,1; 20 см), заполненной Диайон HP-20AG, и элюируют активный компонент 10%-ным (объем/объем) водным .ацетоном и обессоливают. Лктивную фракцию лиофилизируют, получая 1,5 мг натриевой соли антибиотика PS-7 в виде белого лиофилизированного препарата.

Подобные процедуры повторяют для

получения препаратов.

Полученные такии образом натриевые соли антибиотиков PS-6 и PS-7 показывают следующие физико-химические свойства соответственно,

I. Антибиотик PS-6.

Антибиотик PS-6 бесцветный, растворим в воде и по существу не растворим в ацетойе.

Точка разложения.-При измерении на приборе Кофлера для определения точки плавления микроколичеств ВУ-1 с повышением температуры со скоростью 1®С/мин препарат постепенно превращается в коричневый и начинает сокращаться в объеме при . Около 220®С окраска препарата медленно меняется -до коричневой -смолы..

УФ-спектр поглощения.

Растворяют б мг антибиотика PS-6 натриевой соли в 3,0 мл воды и : снимают спектр на спектрофотометре.

.ймо°с 243,0 км и Л ,0 им.

К водному-раствору этого препарата в дистиллированной воде прибавляют раствор гидроксиламина. (рН 7,5), чтобы достичь концентрации PS-6 20 мг/мл и концентрацию последнего 10 мМ. После 30 мин при 22С еакционная смесь теряет примерно . 95% первоначальной оптической рлотности при 300,0 нм.

Цветные реакции.

. Реакция с реактивом Эрлиха полоительная. .

Реакция с иодом-хлорплатиновой кислотой положительная.

Нингидринная реакция отрицательая.

Хроматография на бумаге.

Антибиотик показывает слеующие величины RJ на Тойо фильтровальной бумаге № 50 со следующими астворителями при нисходящей хроатографии на бумаге:

Kf

0,41 0,65

ЭДТК - смесь растворителей, состоящая из 120 мл ацетонитрила, 30 мл 1/10 М Трис Соксиметил)-аминоме- : тан-НС буферного раствора (рН 7,5) и 1 мл 1/10 М водного раствора этилендис1Минтетраацетата натрия (рН 7,5).

Тонкослойная хроматография (ТСХ)..

Антибиотик PS-6 подвергают хроматографии на листе 13254 целлюлозы с указанными растворителями, при этом величины R.J. следующие:

Н-Бутанол/этанол/вода (4/1/5),

(верхний слой)0,67

0,69

0,70 0,68

Электрофорез при.высоком напряжении на бумаге.

0

Антибиотик PS-6 анализируют с по.мощью электрофореза на бумаге под действием высокого напряжения.

При проведении электрофореза в течение 30 мин после охлаждения (ниже 4°С) при потенциале 42 В/см

5 -В буферном растворе (.рН 8,6), содержащем 3,3 г барбитала и 25,5 г натриевой соли барбитала в 3000 мл воды, антибиотик PS-6 продвигается вперед к аноду на 28 мм.

0

Антимикробные свойства.

Были определены минимальные ингибирующие концентрации МИК величины натриевой соли антибиотика.PS-6

5 на различных патогенных микроорганизмах, включая резистентные штаммы, с помощью методики разбавления бульона, используя среду .Брайн Хиарт Инфужн Брос Эйкен.

Препарат натриевой соли антиби0отика PS-6 растворяют в Брайн Хиарт Инфужн Брос Эйкен при концентрации в интервале 5-10 мг/мл, из которой готовят подходящие - серии разбавления в той же жидкой среде. Мик5роорганизмы культивируют в течение 18 ч в Брайн Хиарт Инфужн Брос Эйкен при 28°С и инокулируют в разбавленные серии антибиотик PS-6 при конечной величине инокулума клеток/мл. После стандартной

0 культуры при в течение 20 ч регистрируют рост микроорганизмов в каждом разбавлении- антибиотика PS-6. Минимальная ингибирукицая концентрация (МИК) представляет собой

5 самую низшую концентрацию препарата натриевой соли антибиотика PS-6, при которой не имеется визуального подтверждения размножения указанного микроорганизма. Для контроля два

0 известных -лактамных антибиотика цефазорин и цефокситин - растворяют в Брайн Хиарт Инфужн Брос при рН 7,0 при концентрациях в интервале 1 - 100 мг/мл; готовят серии нескольких разбавлений в указанной жидкой Среде и обрабатывают, как указано выше для определенной МИК.

Мощность и синергетическое действие антимикробной активности известных р-лактамных соединений против р-лактамрезистентных микроорганизмов .

Засевают 10 мл 2,5 раза разведенным питательным агаром (рН 7,0), содержащим 50 мг/мл пенициллина G

или цефалоридина, микроорганизмами, продуцирующими В-лактамазу, и R-лактамрезистентными микроорганизмами и выливают в 9 см чашки Петри, чтобы обеспечить агаровую пластину для проведения биоиспытаний. На эту пластину помещают мягкий диск, 8 мм, содержащий 20 мл раствора антибиотика PS-6 с концентрацией 240 мг/мл, и инкубируют при 35 в течение 18 ч прежде, чем регистрировать зоны ингибирования. Контрольную пластину для проведения биоиспытаний готовят подобным образом без пенициллина G или цефалоридина, В качестве стандартных антибиотиков в тех же условиях наносят на диски для испытаний 10000 мг/мп пенициллина G -или 20 мл цефалоридина,

Результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА общей формулы 4tfH . (НГ pjК--ЙоОКэ где , R2.-(-CH2-CH -), антибиотик PS-6; R(-H, R2-() , R.-H - антибиотик PS-7, отличающийся тем, что штамм Streptomyces А 271.выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных условиях при 20-37 с и рН 5-9 с последующим выделением целевого продукта в виде. комплекса и разделением его на антибиотики PS-6 и PS-7 и/или переводом их в соли, и/или переводом антибиотиков PS-6 и PS-7 и/или их солей в соединение, где низший алкил или группа трифенилметила. 2. Способ -по п. 1, о т л и ч а ю. щ и и с я тем, что, с целью поI вышения выхода антибиотика PS-6, в питательную среду в, процессе кульОТ тивирования вводят валив и/или лейцин, или Н-валериановую кислоту.Приоритетпо признакам: 113.10.77 получение антибиотика PS-6; 29.12.77 получение антибиотика PS-7.

5 Proteus vulgaris

PS-614,0

Пенициллин G15,0

Цефалоридин12,0

PS-622,0

Пенициллин G 0,0 Цефалоридин 12,0 PS-6 20,0

Serratia marcescens

Пенициллин G 0,0 S-18 Цефалоридин 11,0

Из результатов, приведенных в табл. 1,видно, что добавление антибиотика PS-6 к пенициллину G или |цефал9ридину при концентрации ниже определяемого предела четко показывают синергетический эффект против р-лактамрезистентных микроорганизмов. Добавление пенициллина G или цефалоридина вместо антибиотика не оказывает синергетического действия. Активность in vivo. : Изучают терапевтическую активность препарата из натриевой соли антибиотика PS-6 путем введения мышам, которые были интраперитонеально заражены 5-10 клеток/мышь Staphylococcus aureus Smith. Вскоре после заражения подкожно вводят препарат натриевой соли антибиотика PS-5. У ДЦУ самцов мышей Shizuoka) 50%-ная лечебная доза этого препарата равна 5,2 мг/кг.

, Токсичность.

Водный раствор для инъекций препарата натриевой ссГли антибиотика PS-6 интраперитонеально вводят самцу мыши (Shizuoka) дозой 500 мг/кг. Острой токсичности не обнаружено.

28,5 15,0 12,0 2,0

0,0

12,0

26,0

0,0

0,0

11,0

11,0

II. Антибиотик PS-7.

Антибиотик PS-7 растворим в воде, но практически не растворим в ацетоне.

Определенной точки плавления продукт не имеет, он постепенно размягчается при 145-150 0, сокращается в объеме и выглядит твердым с окраской при 220С.

УФ-спектр поглощения Я 220,0 нм и R j Q|°j,,0 нм.

Теряется примерно 95% поглощения при 308,0 нм, когда прибавляют водный раствор гидроксиламина (рН 7,5), чтобы деионизировать водный раствор продукта, концентрации продукта и гидроксиламииа устанавливают таким образом; примерно 20 мг/мл и 10 мМ соответственно, смесь инкубируют при в течение 30 мин.

Цветные реакции.

Реакция с реативом Эрлиха положительная.

Реакция с иод-хлорплатинатом положительная.

Реакция с нингидриномотрицательная.

Антибиотик PS-7 дает следующие 5 величины R при нисходящей хроматографин на бумаге с .использованием Тойо фильтровальной бумаги № 50 со следующими системами растворите лей: Ацётонитрил (Трис/ЭДТК) Этанол/вода (7/3)0,68 Тонкослойная хроматография (ТСХ Антибиотик PS-7 показывает след |Ющие величины R.J в ТСХ на хроматограммных пластинах 13254 из целлю лозы (№ 6065) со следующими систем .ми растворителей: м-Бутанол/этанол/вода (4/1/5) (верхний слой)0,65 Н-Пропанол/воДа (7/3)0,81 Н-Бутанол/йзопропанол/:дода (7/7/6) 0,71 , Ацетонитрил/во. да (8/2)-0,65 Электрофорез высокого напряжени на бумаге. Наблюдают следующую миграцию ан тибиотика PS-7 на Тойр фильтроваль ной бумаге № 50 в буферном раствор со следующими величинами рН, используя аппаратуру для электрофоре за высокого напряжения на бумаге: антибиотик PS-7 мигрирует к аноду на расстояние 28 мм в буферном рас воре, содержащем 3,3 г барбитала, 25,5 г барбитала натрия и 3000 мл воды, рН 8,6 при напряжении 42 В/с в течение -30 мин. Антимикробный спектр. Определяют минимальные ингибиру ющие концентрации на различных пато генных штаммах, включая резистентные к антибиотику PS-7 штаммы, путе метода разбавления Брайн Хиарт Инф среды Эйкен. Растворяют натриевую соль антибиотика PS-7 и разбавляют Брайн Хи арт Инфужн средой Эйкен при концентрации 5 - 100 мг/мл. Далее рас вор разбавляют, той же средой для

Антибиотик- PS-7

vulgaris р-5

Пенициллин G

Цефалоридин

iC-V

19,0

2; ,,. 15,0

11,0 15,0

12,0

12,0 получения серии геометрических кон центраций. К разбавленным сериям прибавляют посевную культуру, приготовленную при культивировании со встряхиванием различных испытуемых микроорганизмов, указанных в Брайн Хиарт Инфужн среде при 28с в течение 18 ч, конечная концентрация клеток составляет IlO мл. Рост клеток исследуют после инкубации при в течение 20 ч. Наименьшая концентрация, при которой не наблюдается рост клеток, является минимальной ингибирукяцей концентрацией антибиотика PS-7 для испытуемого микроорганизма. 1 Мощность и синергетическое действие на антимикробную активность р-лактамных антибиотиков против р-лактамрезистентных микроорганйзмов.Прибавляют цефалоридин к разбавленной в 2,5 раза питательной среде (рН 7,OJ и инркулируют среду р-лактампродуцирующйм штаммом, который продуцирует р-лактамазу. Разбрызгивают 10 мл среды и от;верждают в чашке Петри диаметром 9 см, чтобы приготовить пластину для испытаний. Растворяют антибиотик PS-7 при концентрациях 50 и 29 мг/мл соответственно. Каждыми 20 мл раствора и растворами, разбавленными в два Я четыре раза, смачивают мягкий диск диаметром 8 мм. На поверхности укаванной питательной среды помещают мягкий диск и определяют размер зоны ингибированид около диска после ингибирования при в течение 18 ч. В качестве контрольного эксперимента проводят подобный эксперимент в подобной среде без добавления цефалоридина. Кроме того, для сравнения также проводят подобный эксперимент с мягким диском, смоченным 20 мл раствора 10000 мг/мл пенициллина G или цефалоридина вместо антибиотика PS-7. Результаты приведены в табл. 2. Таблица 2

-Лэктамрезистентный

Диск штамм

Антибиотик PS-7

Citrobacter freundii Е-9

Пенициллин G Цефалоридин

Антибиотик PS-7

Serrati-a marcescens S-18

Пенициллин G Цефалоридин

Результаты табл. 2 показывают, , что в дополнение к антибиотику PS-7 наблюдается очевидное увеличение антимикробной активности на р-лактамрезистентных штаммах у пенициллина G или цефалоридина при таких койцентрациях, когда не проявляется антимикробная активность без добавления. При добавлении пенициллина G или цефалоридина вместо антибиотика PS-7 увеличения антимикробной активности не наблюдается.

Активность in vivo.

Определяют активность полученного антибиотика PS-7 на мышах, зараженных Staphylococcus aureus при 5-10 клеток на мышь интраперитонеально. Вводят натриевую соль антибиотика PS-7 NttjmaM сразу после заражения. Соединение имеет величину .,5,мг/кг соответственно у самца мыши ДЦУ (Shizuoka).

Токсичность.

Не наблюдается острой токсичности у самцов vtxasti (Shizuoka), которым интраперитонеально вводили.натриевую соль антибиотика PS-7.

Продолжение табл.2

Диаметр зоны ингибирования

Добавка цефаНет добавки лоридина

13,5 0,0 0,0

0,0

0,0 12,0 12,0

18,0

11,0 0,0

14,0

0,0 0,0

0,0

0,0 11,0 11,0

Пример 10. Тритиловый эфир антибиотика PS-6.

Растворяют 25,9 мг белого свежевысушенного препарата антибиотика PS-6 - натриевой соли, полученной в соответствии с методикой/ описанной в примере 9, в 5 мл диметилформамида и 20 мл триэтиламина, а потом прибавляют 50 мл тритилхлорида. После перемешивания в течение 3 ч при комнатной температуре реакционную смесь разбавляют 200 мл бензола и три раза промывают 70 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора fpH 6,8). После дегидратации путем прибавления 3 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия бензольный раствор сушат, добавляя безводный сульфат натрия. Бензол отгоняют при пониженном давлении, получая около 0,5 мл бензольного раствора, который пропускают через колонку (1,2к96,0 см) Био-Биидс 5-ХЗ. Колонку проявляют бензолом. Объединяют полученные таким с бразом активные фракции и концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в О,5 мл ацетона и загружают в колонку t 1/296.,О см) с Сефадексом LH-20, который предварительно уже набух в ацетоне, колонку проявляют ацетоно Объединяют активные фракции и концентрируют досуха при пониженном давлении, получая 23,7 мг белого порошка. Перекристаллизацией этого порошка из смеси бензола с н-гекса ном получают 17,5 мг бесцветного кристаллического порошка тритилового эфира антибиотика PS-6. Это бесцветный кристаллический порошок. . .УФ-спектр поглощения тритилового эфира антибиотика PS-6i при концентрации 100 мг/3 мл метанола а МеОН -э- - р . , I/иакс V нм.4 Не растворим в воде и Н -гексане, хорошо растворим в бензоле, этилацетате, хлороформе, метаноле, этаноле, ацетоне, диметилформамиде (ДМФ) и диметилсульфоксиде (ДМС Цветные реакции. Реакция с реа.ктивом Эрлиха поло жительная. Реакции с иодом-хлорплатиновой кислотой положительная. Реакция с нингидрином отрицател иэя. Тонкослойная хроматография (ТСХ Участок миграции оценивают биоаутографией на Comamorias terrigena В-996. тех силикагелевую пластину испо зуют и перед нанесением пятна, наносят пятно 2,5 мл ацетонового рас вора, содержащего 10% диметилформа мида. Величины Rf следующие Бензол/аце-R# тон (2/1)0,37 Бензoh/этилацетат (1/8)0,34 Антимикробный спектр. Величины МИК (минимальных ингиби рующих концентраций) соединения оп ределяют на различных патогенных ми роорганизмах, включая несколько ре зистентных штшчмов, используя .метод разбавлений в среде Врайн Хиар Инфужн Врос Эйкен. Тритиловый эфир антибиотика PSрастворяют в малом количестве метанола и разбавляют по возможности быстро Брайн Хиарт Инфужн Брос Эйкен (рН 7,0) до концентрации трити лового эфира антибиотика PS-6 в интервале 40-- 20 мг/мл, концентрация метанола в конечном растворе не превышает 10%. Раствор разбавляют в двукратные геометрические серии. Микроорганизмы культивируют в течение 18 ч при 28®С в Брайн Хиарт Иифужн Брос Эйкен и инокуг лируют р указанные серии разбавлени при конечной величине инокулума клеток/мл. Результаты опреде|ДЯЮТ после инкубации в течение 20 ч лри 35®С. Величины минимальных ингибирующих концентраций (МИК) означают самую низкую концентрацию единиц тритилойого эфира антибиотика PS-6, когда не наблюдается роста соответствующего микроорганизма в указанных выше условиях. Активность in vivo тритилового антибиотика PS-6 измеряют на мышах, которые были интраперитрнеально заражены 5 10 клёток/мьпиь StaphyJococcus aureus Smith. Тритилированный продукт антибиотика PS-6 вводит подкожно почти сразу после .инфицирования. 50%-ная лечебная доза для самцов ДЦУ мышей (ШИЗУОКА) составляет 5,5 мг/кг. Токсичность. Не наблюдалось острой токсичности у самцов ДЦУ мьпдей (Shizuoka) при введении интраперитонеальной дозы тритилового эфира антибиотика PS-6 500 мг/кг. Пример 11. Растворяют 24,5 мг белого свежевысушенного препарата натриевой соли антибиотика PS-7, полученной по методике примера 9, в 5 мл диметилформамида и прибавляют 20 мл триэтиламина и затем 50 мг тритилхлорида. После 3 ч Перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь разбавляют 200 мл бензола и три раза промывают 70 мл О , 1 М pacTBOpai фосфатного буфера (рН 6,8). После дегидратации путем добавления 3 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия бензольный раствор сушат, добавляя безводный сульфат натрия. Бензол частично отгоняют при пониженном давлении, получая около 0,5 мл бензольного раствора, который затем пропускают через колонку (i;i.,0 см) БИО-БИИДС 5-ХЗ. Колонку проявляют бензолом. .Полученные таким образом активные фракции объединяют и концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в 0,5 мл ацетона и пропускают через колонку (1,2. Х96,0 см) с Сефадексом LH-20, который уже предварительно набух в ацетоне, и проявляют ацетоном. Объединяют активные фракции и концентрируют досуха при пониженном давлении получая 20,5 мг продукта в виде белого порошка. При перекристаллизации Порошка из смеси бензола с ц-гексаном получают 15,5 мг бесцветного кристаллического порошка тритилового эфира антибиотика PS-7. Это бесцветный- кристаллический порошок . УФ-спектр поглощения тритилового эфира антибиотика PS-7 снят на 3 итачи Дубль Биим Спектрофотометре Модель 200-20 при концентрации 100 мг/3 мл метанола. Я 230, 5 321,5 им. Растворимость тритилированного продукта антибиотика PS-7 определя ют путем растворения при встряхива НИИ 5 мг каждого тритилированного продукта антибиотика FS-7 в 0,1 мл каждого из следующих растворителей при . Продукт не растворим в воде и W-reKcaHe, хорошо растворим бензоле, этилацетате, хлороформе, метаноле, этаноле, ацетоне, диметилформамиде (ДМФ) и диметилсульфоксиде (ДМСО). Цветные реакции. Реакция с реактивом Эрлиха поло жительная. Реакция с иодом-хлорплатиновой кислотой положительная. Реакция с нингидрином отрицател пая, Тонкослойная хроматография. Тритиловый эфир анти-биотика PSдает следующие величины при указан ных условиях. Величину миграции определяют биоаутографией на Сота monas terrigena В-996. Используют силикагельную пластину для тех и перед нанесением ка ли капают 2,5 мл ацетонового раств ра, содержащего 10% диметилформамида. Получают следующие велину R в следующих растворителях бензол/ацетон (2/1)0,51 Бензол/ацетон (1/1)0,67 Антимикробный спектр. Определяют минимальные ингибирующие концентрации (МИК) соединен на различных патогенных организмах включая некоторые резистентные шта мы, используя метод разбавленной культуры в Брайн Хиарт Инфужн Брос Эйкен, Растворяют Тритиловый эфир антиби тика PS-7 в малом количестве метанола и разбавляют по возможности быстро в среде Брайн Хиарт Инфужн Брос Эйкен (рн 7,0) до концентра ции тритилового эфира антибиотика PS-7 в интервале 40 - 20 мг/мл, а концентрация метанола в конечном растворе не превышает 10%. Этот раствор разбавляют в двукратные ге метрические серии. Микроорганизмы культивируют в течение 18 ч при в Брайн Хиарт Инфужн. Брос Эйкен и инокулируют в вышеупомянутые серии разбавленной при конеч ной величине инокулума 1X10 клеток/мл. Результаты еценивают после инкубации при 35®С в течение 20 ч Величина минимальной ингибирующей концентрации означает самую низкую концентрацию единиц тритилового эфира антибиотика PS-7, при которой не наблюдается рост соответствующего микроорганизма в описанных условиях. Тритиловый эфир антибиотика PS-7 обладает широким антимикробным спектром и, в частности, проявляет сильную антибиотическую активность по отношению к различным ( -лактамрезистентным (продуцирующим р-лактамазу) штаммам микроорганизмов. Активность in vivo. Активность in. vivo тритилового эфира антибиотика PS-7 измеряют на мышах, которые были интраперитонеально заражены 5;ч l.O клеток/мышь Staphylococcus aureus Smith. Тритилированный продукт антибиотика PS-7 инжектируют подкожно сразу после заражения. 50%-ная лечебная доза на самцах ДДУ мышей (Shizuoka) составляет 4,5 мг/кг. Не наблюдается острой токсичности, у самцов ДДУ мышей (Shizuoka) при введении тритилового эфира антибиотика PS-7 интраперитонеал# но дозой 500 мг/кг. Пример 12. Метиловый эф.ир антибиотика PS-6. . Суспендируют 2,0 иг лиофилизированного препарата, полученного в примере 9, в 1 мл сухого диметилформамида (дМФ), в который добавляют 20 мл триэтиламина и 50 мл метилиодида. После перемешивания смеси в течение 2 ч при комнатной температуре отбирают примерно 20 мл смеси, растворяют в метаноле и определяют увеличение поглощения при 315 нм на Хитачи Рекординг Спектрофотометре Модель ЕР5-ЗТ, чтобы под.твердить прохождение реакции. После подтверждения всю реакционную смесь выливают в 20 мл бензола и немедленно промывают дважды, каждый раз по 10 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0). Бензольный раствор дегидратируют над безводным сульфатом натрия и концентрируют до 1 мл при 35®С при пониженном давлении. Концентрированный раствор пропускают через колонку (1,2Л iX85 см) Био-Биидо S-X3 и проявляют бензолом. Элюат проявляют тонкослойной Хроматографией (Киезельгель 60 р254 бензол/ацетон (1/1), собирают после идентификации фракции элюата, содержащие метиловый эфир антибиотика PS-6, идентификацию проводят с помощью УФ-спектроскопии. Фракции концентрируют досуха при пониженном давлении, получают бесцветное маслянистое соединение, которое растворяют в 1 мл ацетона. Ацетоновый раствор пропускают через колонку с (1,2x85 см) Сефадекса LH-20, который был уже пред вари тально набухшим в ацетоне, и проявляют