Способ получения тиаминтрифосфата Советский патент 1990 года по МПК C07F9/09 A61K31/675 

и резко повысить стабильность ТТФ в процессе хранения.

В отличие от известного способа, в котором для очистки ТТФ используют сильнокислую ионообменную смолу, согласно предлагаемому способу для очистки последовательно используются три различные модификации сшитого поли- декстрана - геля сефадекс, которые . предназначены для гель-фильтрации и ионного обмена и различаются функциональными группами, привитыми к по верхности геля: сефадекс G-10 не модифицирован, ДЕАЕ-сефадекс А-25, модифицированный диэтиламидной группой, и SP-сефадекс С-25, модифицированный карбоксильной или сульфогруппой SO Н. Снижение температуры или времв ни реакции соответственно ниже ,и 70 мин ведет к увеличению содержания в реакционной смесу непрореагиро--; вавшего тиамина, а повышение температуры свыше 70 С и времени более 90 мин - к нарастанию содержания про- дуктов термической деградации фосфорных эфиров тиамина (тиамина и тиамин- монофосфата) .

Таким образом, любое отступление от приведенных условий приводит к уменьшению выхода ТТФ и снижению его качества.

Пример 1. Ортофосфорную кислоту предварительно обезвоживают при , в вакууме в течение 6 ч. Затем 11,25 г (0,11 моль) 98%-ной.ортофос- форной кислоты и 8,75 г (0,06 моль) фосфорного ангидрида нагревают при 65 С до образования однородной массы и добавляют при непрерывном перемеши- вании 5 г (0,016 моль) тиаминхлорида- гидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают, перемешивая при данной температуре 80 мин, охлаждают до 20°С, вносят 24 г измельченного льда и снова перемешивают до полного растворения (температура бани ) . Охлажденный раствор медленно приливают к 0,5 л безводного ацетона ) и оставляют на холоду на 15 ч. Отстоявшийся водно-ацетоновый слой удаляют, а в остатке получают 13,6 г фосфори.- лированного тиамина.

Осажденная органическим растворителем смесь еще содержит значительные остаточные концентрации свободной и солеобразующей фосфорной кислоты, гидр ОЛИ зу5ощей лабильные фосфорноэфир ные связи синтезированных производ

5 О 5

0

5

ных. Для ее удаления из раствора осадок фосфатбв тиамина растворяют в 20 мл дистиллированной воды и пропускают через колонку (5,6x70 см) с се- фадексом G-10 со скоростью 24 мл/ч на 1 см. Фосфорные эфиры тиамина элюируют водой с той же скоростью, собирая фракции по Ю мл. За качеством очистки от фосфорнокислых примесей следят с помощью высокочувствительной реакции на фосфор, а также визуально по образованию белого кристаллического осадка Ва (70) при добавлении к аликвотам элюата уксуснокислого Ва. Концентрацию эфиров .тиамина регистрируют тиохромным методом и спектрофотометрически по молярной экстинкции раствора (Е . 7400 см- .М-О при Л 272,5 нм. При гель-фильтрации на сефадексе элюируется несколько пиков, (фиг.1), из которых пик 2 фосфорной кислоты расположен на значительном удалении от пика 1 тиаминофосфатов.

Разделение фосфатов тиамина осуществляют в виде их внутренних солей бетаинового типа методом ионообменной хроматографии. Свободные от фосфорной кислоты фракции первого пика от 28 по 42 (фиг.1) объединяют, рН доводят 0,02 М трис-НС буфером до 7,4 и наносят на колонку (2,6x40 см) с анио- нообменным гелем ДЕАЕ-сефадекс А-25, уравновешенную этим же буфером. Тиамин не связывается с анионообменником и вымывается в пустом объеме колонки. После его удаления из раствора фосфаты тиамина элюируют линейньш градиентом LiCl от 0,1 до 0,4 М (по 300 мл в каждом сосуде) со скоростью 18 мл/ч . на 1 см. При хроматографии на ДЕАЕ- сефадексе получают шесть четко выраженных пиков с типичными тиаминовыми спектрами (фиг.2): пик 1 соответствует тйамиимонофосфату (ТМФ) и вьмыва- .- ется 0,12-0,16 М LiCl, пик 2 - тиа--н миндифосфату (ТДФ) (0,17-0,21 М LiCl), пик 3 - ТТФ (0,22-0,25 М LiCl), пикы 4 - 6 - полифосфатам тиамина (0,26- 0,29; 0,30-0,33 и 0,34-0,36 М LiCl). Расчет процентного содержания отдель- . ных фосфатов в индивидуальных пиках показывает, что на долю тиаминмоно-,. ДИ-, три- и полифосфатов приходится I роответственно 25,0; 37,1; 28,6; 5,9; tj8 и 0,7% всего наносимого ткамина (Т)..,0,9% его оказалось в нефосфори- лированной, свободной форме. Степень

хроматографического разделения и идентификацию фосфатов оценивают методом восходящей хроматографии на бумаге FN5 в системе растворителей: Н-пропанол - вода - 0,1 М фосфатный буфер, рН 5,0 (3:1:1). ТТФ находят в реакции со специфической тиамин- трифосфатазой мозга. Наличие ТДФ в составе ТТФ фиксируют ферментатив- .но, рекомбинацией ТДФ, как кофермен- та, с апогшруватдекарбоксилазой.

Частичное перекрывание пика ТТФ пиком синтезирующегося в более высоких концентрациях дифосфорного эфира Т (фиг.2) приводит к незначительному, но достаточному для торможения специфической тиаминтрифосфатазной реакции загрязнению ТТФ остаточным ТДФ. Полная очистка ТТФ достигается на кати- онообменном геле SP-сефадекс С-25. Элюируемые с ДЭАЭ-сефадекса фракции пика 3 (фиг.2) объединяют, упаривают до минимального объема (1 мм;.)

30

J -1,ълог..4. UJLV J. И 1 1хИС

(оксиметил)-аминометана к 10-кратному объему охлажденного до абсолютного этанола. Смесь перемешивают 20 мин, а фосфорные эфиры осаждают при из 10-кратного объема безводного ацетона. После вьщерживания в течение 15 ч при 18 С фосфаты отфильтровывают, повторно экстрагируют водой (2 мл) и перекристаллизовывают из смеси абсолютных этанола и ацетона в соотношениях 1:10. Выпавший осадок фильтруют, растворяют в 1 мл 0,005 М натрийацетатного буфера,. рН 3,8 и наносят на колонку (1,2x60 см) с, катионообменником SP-сефадексом С-25, уравновешенную этим же буферным раст- 40 вором. Скорость тока жидкости через колонку 15 мл/ч на 1 см, объем фракции 2 МП. ТТФ не сорбируется катионо- обменником нг вымывается в пустом объеме колонки основным пиком 1, (фиг.З). ТДФ значительно запаздьгаает, злюируясь позже минорным пиком 3 (фиг.З). Между пиками 1 и 3 фосфатов тиамина располагается небольшой -пик 2 (фиг.З) неидентифицированной природы с нетиаминовым спектром.

Очищенный препарат ТТФ не содержит примеси фосфорной кислоты и других фосфатов тиамина, однако, в водном растворе недостаточно устойчив, постепенно гидролизуясь до ТДФ (на 1,6- 2,0% в течение 3 мес хранения при ). Для стабилизации молекулы элюи- руемые-с SP-сефадекса С-25 фракции

1594179. 6

пика 1 (фиг.З) упаривают на ротор испарителе до 5 мл, охлаждают до и при интенсивном перемешивании в среде сухого азота, во избежание окисления ТТФ, приливают по капля 20% LiOH до нейтральной реакции. воритель частично упаривают (1 мм 18 с), а к небольшому объему (1 м д литиевой соли трифосфорного эфира тиамина добавляют при перемешиван 10-кратный объем смеси абсолютног ,этанола и ацетона (1:10). Раствор тавляют на 15 ч при , после че 15 сформировавшиеся кристаллы отфиль |вывают. Для полноты экстракции и точного LiOH и сконцентрировавшег при упарийании буферного раствора CHjCOONa переосаждение ТТФ осущес 20 ляют трижды. Выделившиеся кристалл промывают охлажденным этанолом и шат в вакууме над . Выход цел го продукта составляет 256 мг (5, Литиевую соль ТТФ хранят в среде с

eZb-s:- L Г ™ т.-гГзо -

О С, Устойчивость контролируют чер каждые 3 мес хранения (табл.3).

П р и М е р 2. Берут 11,25. г (0,11 моль) предварительно обезвож ной в вакууме при в течение 98%-ной ортофосфорной кислоты и 8, (0,06 моль) фосфорного ангидрида и нагревают до образования однородно массы при , после чего добавля 35 при непрерывном пе ремешивании 5 г

(0,06 моль) тиаминхлоридагидрохлор : да. Реакционную смесь вьщерживают, помешивая при данной температуре , 70 мин, охлаждают до 20°С, вносят 24 г измельченного льда и снова пе мешивают до полного растворения (т пература бани ) . Дальнейшие опе ции получения ТТФ (осаждение органи . ческим растворителем образовавшейся 5 за время фосфорилирования смеси фо форных эфиров тиамина, разделение фосфатов тиамина методами ионообмен ной хроматографии на анионо- и катй онообменных смолах и перевод получе 50 ного- раствора тиаминтрифосфорной ки лоты в литиевую соль, в среде сухог азота) проводят способом, идентичны способу, описанному в примере 1. Вы ход целевого продукта составляет 55 216 мг (5%).

Влияние температуры на скорость фосфорилирования тиамина за 70 мин протекания реакции показано в табл. зависимость скорости синтеза фосфор

594179. 6

пика 1 (фиг.З) упаривают на роторном испарителе до 5 мл, охлаждают до и при интенсивном перемешивании в среде сухого азота, во избежание окисления ТТФ, приливают по каплям 20% LiOH до нейтральной реакции. Растворитель частично упаривают (1 мм; 18 с), а к небольшому объему (1 мл) д литиевой соли трифосфорного эфира тиамина добавляют при перемешивании. 10-кратный объем смеси абсолютного ,этанола и ацетона (1:10). Раствор оставляют на 15 ч при , после чего 15 сформировавшиеся кристаллы отфильтро- |вывают. Для полноты экстракции точного LiOH и сконцентрировавшегося при упарийании буферного раствора CHjCOONa переосаждение ТТФ осуществ- 20 ляют трижды. Выделившиеся кристаллы промывают охлажденным этанолом и суг-г шат в вакууме над . Выход целевого продукта составляет 256 мг (5,1%). Литиевую соль ТТФ хранят в среде су ™ т.-гГзо -

™ т.-гГзо -

О С, Устойчивость контролируют через каждые 3 мес хранения (табл.3).

30

40

П р и М е р 2. Берут 11,25. г . (0,11 моль) предварительно обезвожен- ной в вакууме при в течение 6 .ч 98%-ной ортофосфорной кислоты и 8,75 г (0,06 моль) фосфорного ангидрида и нагревают до образования однородной массы при , после чего добавляют 35 при непрерывном пе ремешивании 5 г

(0,06 моль) тиаминхлоридагидрохлори- : да. Реакционную смесь вьщерживают, помешивая при данной температуре , 70 мин, охлаждают до 20°С, вносят 24 г измельченного льда и снова перемешивают до полного растворения (температура бани ) . Дальнейшие операции получения ТТФ (осаждение органи- ческим растворителем образовавшейся 5 за время фосфорилирования смеси фосфорных эфиров тиамина, разделение фосфатов тиамина методами ионообменной хроматографии на анионо- и катй- онообменных смолах и перевод получен- 0 ного- раствора тиаминтрифосфорной кислоты в литиевую соль, в среде сухого азота) проводят способом, идентичным способу, описанному в примере 1. Выход целевого продукта составляет 5 216 мг (5%).

Влияние температуры на скорость фосфорилирования тиамина за 70 мин протекания реакции показано в табл.1. зависимость скорости синтеза фосфорных эфиров тиамина от продолжительности реакции при - в табл.2,

П р и м е р 3, Берут 11,25 г (0,11 моль) предварительно обезвожен ной в вакууме в течение 6 ч при 98%-ной ортофосфорной кислоты и 8,75 г (0,06 моль) фосфорного ангидрида и нагревают до образования однородной массы при 70 с, после чег добавляют при непрерывном перемешивании 5 г (0,016 моль) тиаминхлорида- гидрохлорида. Реакционную смесь выдерживают , помешивая при данной тем- пературе.90 мин, охлаждают до , вносят 24 г измельченного льда и снова перемешивают до полного растворе- ния (температура бани ). Все последующие операции получения ТТФ, а именно осаждение оргаиичесютм раство рителем образовавшейся за время фоС - форилирования смеси фосфорных эфиров тиамина, разделение фосфатов тиамина методами ионообменной хроматографии на анионо- и катионообменных смолах и перевод, полученного раствора аминтрифосфорной кислоты в литиевую соль в среде сухого азота, проводят способом, идентичным способу, описанному в примере 1, Выход целевого продукта составляет 250 мг (5,1%).

Влияние температуры на скоресть фосфор1тирования тиамина за 90 мин протекания реакции показано в табл.1 зависимость скорости синтеза фосфор- ных зфиров тиамина от продолжитель- пости реакции при - в табл.2.

Полученный препарат литиевой соли ТТФ хроматрграфически однороден ив используемой системе бумажного кро- .матографировашгя его подвижность (Кл) составляет 0,22, не отличаясь от таковой для кислой формы ТТФ, выг деленного фракционированием фосфатов на SP-сефадексе С-25 (фиг.З). При рекомбинации ТТФ с апопируватдекарб оксилазой дрожжей не наблюдалось образования холоформы фермента,

тверждая тем самым отсутствие в синтезируемом препарате примесных концентраций ТДФ. Температура плавления кристаллов кислой формы ТТФ равна , солевой (в виде литиевой соли) 281°С. Элементный анализ для кислой формы трифосфорного эфира тиамина.

Найдено, %: С 27,49 ±0,31; Н 3,98 ±0,09:, N 10,67 tO,19; Р 18,l4tO,16; 2,01 to,07. , H.fO.

Вычислено, %: С 28,08,. Н 3,93; N 10,92; Р 18,10; 1,56.

Соотношение числа атомов Li литие- рой соли к.числу молей ТТФ соответст- эует 2.

/ Таким образом, предлагаемый спо- .соб синтеза ТТФ позволяет значительно (от 0,6 до 5,1%) повысить выход ТТФ по сравнению с известным способом и, кроме этого, значительно (от 2 мес до до 2 лет) повысить устойчивость препарата..

Формула изобретения

1.Способ получения тиаминтрифос- фата взаимодействием тиамина хлорида гидрохлорида с фосфорной кислотой

и фосфорным ангидридом при нагревании с последующим выделением целевого про продукта переосаждением из водно- ацетоновой смеси и хроматогра(1ической очисткой, отличающийся тем, что, с целБю повьшения выхода целевого продукта, нагревание ведут до 60-70 С в течение 70-90 мин и хро- матографическую очистку осуществляют последовательно на фильтрующем геле сефадекс G-rlO, на анионообменном геле ,ДЕАЕ-сефадекс А-25 и катионообменном геле SP-сефадекс С-25.

2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что, с целью повьпие- ния стабильности тиаминтрифосфата, его вьщеление осуществляют в виде литиевой соли.

Таблица

Влияние температуры на скорость фосфорилирования тиамина за 70 (а), 80 (б) и 90 мин (в) протекания реакции

Т a б л и

Зависимость степени гидролиза тиаминтрифосфата от времени и формы хранения препарата

ц а 3

Изобретение касается химии фосфорорганических соединений, в частности получения тиаминтрифосфата - трифосфорного эфира витамина В 1, что может найти применение в медицине. Цель - повышение выхода и стабильности целевого продукта. Синтез ведут фосфорилированием тиамина хлорида гидрохлорида смесью фосфорной кислоты и пятиокиси фосфора при 60-70°С в течение 70-90 мин. с последующей последовательной обработкой реакционной смеси на следующих ионообменных гелях: сефадекс G-10, ДЕАЕ сефадекс A-25, SP-сефадекс С-25 с выделением готовой формы целевого эфира в виде литиевой соли. Выход 5,1%, т.пл. кислой формы 194°С, литиевой соли 281°С, брутто-ф-ла кислой формы C 12H 19N 4O 10P 3S .1/2H 2O. Эти условия позволяют повысить выход целевого эфира с 0,6 до 5,1% и стабильность с 2 мес. до 2 лет. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл.

Степень гидролиза тиаминтрифосфата определяют ферментативным методом, по количеству образовавшегося ТДФ, а также хроматогра- фически в системе растворителей н-прогашовый спирт - вода - 0,1М фосфатный буфер, рН 5,0, 3:1:1. Структурную целостность и идентичность хранящегося препарата оценивают по реакции со специфической тиаминтрифосфатазой мозга (Кф 3.6.1.28).

38 2 6 SO Номера срракции

0if3.

П

Ю 20 2 28 32 Номера, срранции

Фиг.г

54 58

вг

36

50 cS :J

E

A S

|25

о

I

5

A

/

j1

V « i-I-1 -

10 72 J J6 Номера cppQHi4uu.

Физ.Ъ

W

A

/

X

.Jb.

W ZO