Способ выращивания уксусно-кислых бактерий @ @ Советский патент 1985 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

а ю

СХ)

05 Изобретение относится к промыш- ленной микробиологии, в частности к способам выращивания уксуснокислых бактерий, преимущественно используемых в производстве аскорбиновой кислоты. Цель изобретения - повьпление скорости размножения бактерий и степени окисления сорбита в сорбозу, П р и м е р 1. Выращивание Gluconobacter oxydans в лабораторных условиях в питательной среде, содержащей панкреатическую ДНКазу. При изу чении влияния панкреатической ДНКазы на скорость размножения уксуснокислы бактерий и на жизнедеятельность микроорганизмов, приявляющуюся в способ ности их окислить сорбент в сорбоэу. Gluconobacter oxydans культивируют в питательной среде следзтощего состава мл: сорбит 400 (23-28%-ный раствор ), дрожжевой-автолизат 60 (б% сухих веществ ), вода 540. Содержание сухих веществ в питательной среде должно быть не менее 10-12%, .рН 5,0-5,6. Дпя подготовки посевного материала двухсуточную культуру с поверхности агаризованной среды указанного состава переносят в пробирки с жидкой средой того же состава, инкубируют в термостате при 32°С в течение 48 ч, после чего суспензию разбавляют в 10 раз свежей средой и разливают по 50 мл в колбы емкостью 500 мл. Одновременно в колбы вносят панкреатическую дезоксирибонуклиазу (ДНКазу )и культуру выращивают при 32С 48 ч. Через 3,12,24,36,48 ч после посева отбирают пробы для регистрации скорости размножения клето определяемой по приросту биомассы на спектрофотометре, при длине волны 640 нм. В этих же пробах контролируют глубину окисления сорбина в сорбо зу. С этой целью отбирают 50 мл испытуемого раствора в мерную колбу емкостью 100 мл, куда добавляют 1 мл 50%-ного раствора азотнокислого свин ца и 1 мл 5%-ного раствора, NaOH. Содержимое колбы доводят до метки во дой, энергично встряхивают и фильтру ют. Затем с помощью поляриметра определяют угол вращения в прозрачном испытуемом растворе. Содержание сорбозы в исследуемой пробе (г/л )определяют по формуле X 0,396 (К-Р )2, где 0,396 - коэффициент соответствия между 1 шкалы поляриметра и содержанием сорбозы в г/100 мл; Р - показания поляриметра; К - величина угла вращения кварцевой трубки; 2 - коэффициент пересчета на нормальную навеску. Глубину окисления сорбита в сорбозу % вычисляют по формуле V С 100 X , ,где С - содержание сорбозы в г/ЮО мл окисленного раствора. В - содержание сухих веществ в г/100 мл окисленного раствора, определенных по рефлектометру. В качестве контроля используют те же условия выращивания уксуснокислых бактерий, но ДНКазу добавляют в питательную среду, и гактивированнзш путем нагревания при 100°С 10 мин. Для подбора дозы ДНКазы, стимулирующей ра множение бактерий, используют несколько концентраций фермента 1-10 мл/г, 1-10 мг/мл, 1-10 мг/мп. При соблюдении всех описанных условий проведения опыта не обнаружено стимулирующего влияния ДНКазы в концентрации 1-10 мг/мп на размно- , жение уксуснокислых бактерий и глубину окисления сорбита в сорбозу. Не обнаружено также стимулирующего действия ДНКазы в концентрации 1-10 мл/мл на размножение уксуснокислых бактерий и глубину окисления сорбита в сорбозу. Панкреатическая ДНКаза в концентрации IlO мг/мп способствует ускорению размножения уксуснокислых бактерий . Данные о влиянии панкреатической ДНКазы на размножение уксус- нокисльгх бактерий и глубину окисления сорбита в сорбозу при выращивании G1.oxydans в лабораторных условиях представлены в табл.1 и выражены в процентах стимуляции по от-, ношению к контролю, принятому за 100%. Как видно из табл.1,-уже чпрез 3ч. культивирования в среде с ферментом происходит ускорение размножения клеток на 28,9%. Однако в этот период увеличение глубины окисления сорбита в опыте по сравнению с

3

контролем не наблюдается. Наиболее высокого значения величина стимуляции размножения клеток и окисления сорбита в сорбозу (.29 и 25% сЬответственно . достигает через 12 ч роста культуры в присутствии панкре тической ДНКазы. На протяжении последующих 12 ч роста культуры стимулирующий эффект сохраняется, а к концу периода исследования уменьшается в два раза.

Таким образом, панкреатическая ДНКаза, добавленная в питательную среду вконечной концентрации 110 мг/мл стимулирует размножение клеток в лабораторных условиях культивирования .Gl.uconobacter охуdans. Стимулирующее действие ДНКазы сопряжено с усилием процесса окисления сорбита в сорбозУ. -- П р и м е р 2. Выращивание уксуснокислых бактерий в производственных условиях в прединокуляторе при добавлении в питательную среду панкреатической ДНКазы в конечной концентрации I -10 - мг/мл ( 1 2- среды J.

С целью накопления биомассы в производственных условиях уксуснокислые бактерии выpauц вaют поэтапно, начиная с меньшей емкости прединокулятора (100 м ), и завершая процесс ферментации в емкостях 10000-13000 л.

В прединокуляторе культуру выращивают в течение 12 часов, Основным тестом, определяющим жизнедеятельность бактерий и позволяющим перейти к следующему этапу выращивания клеток в больших емкостях, является глубина окисления сорбита

1628764

в сорбозу этими бактериями, которая через 12 ч дочжна быть не менее 25-30%.

При выращивании культуры в прединокуляторе емкость заливают 60 л питательной среды, засевают 48-часовой клеточной суспензией, выращенной в лабораторных условиях, из расчета 10% на объем среды. Одновременно с инокулятом вводят панкреатическую ДНКазу.

Через каждые 3 ч роста культуры из прединокуляторов отбирают пробы для определения влияния панкреатической ДНКазы на глубину окисления сорбита в сорбозу. Результаты исследований представлены в табл.2.

Из табл.2 видно, что выращивание клеток в прединокуляторе в присутствии ДНКазы в течение 9 ч приводит к стимуляции .окисления сорбита в сорбозу на 40-60%. Через 12 ч роста культуры стимулирующий эффект уменьшается, однако сохраняется на уровне 14-28%. Полученные результаты позволяют заключить, что ДНКаза, добавленная в среду культивирования, положительно влияет на жизнеспособность уксуснокислых бактерий. Глубина окисления сорбита в сорбозу через

,9 ч выращивания бактерий в среде с ДНКазой достигает 25-30%, что

-позволяет перевести культуру из прединокулятора в следующую емкость (инокулятор ) и, следовательно, сократить продолжительность выращивания клеток в прединокуляторе на 3ч.

Таблица 1

СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ УКСУСНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS, предусматривающий приготовление инокулята клеток бактерий с последующим внесением его в питательную среду, содержащую сорбит в качестве источника углерода и дрожжевой автолизат в качестве стимулятора роста, отличающийся тем, что, с целью повьпиения скорости размножения бактерий и степени окисления сорбита в сорбозу, внесение инокулята в питательную среду осуществляют совместно с панкреатической дезоксирибонуклеазой, взятой в концентрации Ы( 2-10 мг/мл. (Л

28,9 29,0 17,6 10,3 10,5

О

25,0 20,0 18,2 12,8

Примечани е:Процент стимуляции выражен по отношению

к контролю, принятому .за 1СО%. Контроль - глубина окисления в соответствующих прединокуляторах без ДНКазы,

Таблица 2