СПОСОБ БИОДЕГРАДАЦИИ ИПРИТСОДЕРЖАЩИХ СМЕСЕЙ, ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SPECIES 8-2 - БИОДЕГРАДАТОР ИПРИТА, ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS DOUDOROFII 70-11 - БИОДЕГРАДАТОР ИПРИТА И ШТАММ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM SPECIES КЗБ - БИОДЕГРАДАТОР ИПРИТА Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/38 C12R1/15 

Изобретение относится к прикладной микробиологии, а именно к способам микробиологической переработки химических препаратов, в частности химического оружия.

В настоящее время микроорганизмы достаточно широко используются для очистки почвы и воды от веществ, загрязняющих окружающую среду, в частности нефти и нефтепродуктов, нитратов, фосфорорганических веществ (ФОВ), например пестицидов и т.д. [1]. Однако в каждом конкретном случае необходим скрининг микроорганизмов, способных осуществлять необходимую деструкцию токсичных структур.

Среди способов биодеградации химических отравляющих веществ (ХОВ) наибольшее число работ посвящено уничтожению ФОВ типа VX. Для гидролиза C-P связи в подобных соединениях используются микроорганизмы ряда Pseudomonas [2, 3].

Наименее изучаемыми являются процессы биодеградации иприта бис(2-хлорэтил)сульфида, который способен до 50 лет после попадания в почву сохранять поражающие свойства [4] , хотя вещество и способно гидролизоваться на ипритхлоргидрин и тиодигликоль или на 1,2бис(2хлорэтилтио)этан, 1,2-дихлорэтан и 1,4-дитиан, а также высокомолекулярные аддукты [1, 4, 5].

Известно, что для разложения иприта в водных растворах могут быть использованы штаммы Pseudomonas testosteroni, Pseudomonas putida, выделенные из донного ила Мексиканского залива и утилизирующие тиодигликоль [6]. Однако данные штаммы применяются только после гидролиза иприта.

Прототипом заявляемой группы изобретений является способ, заключающийся в использовании для деградации микроорганизмов рода Pseudomonas (гетеротрофы) или Tiobacillus (хемотрофы), полученных методом накопительных культур и разлагающих иприт на метан, углекислый газ, хлориды и сульфаты [7] .

Подробная информация об использованных микроорганизмах в литературе, доступной для неопределенного круга лиц, отсутствует.

Задачей, решаемой авторами, являлось: поиск режима обработки иприта и подбор штаммов, позволяющих утилизировать негидролизованный иприт, а также позволяющих на его основе получать вещества, представляющие коммерческий интерес.

Задача решается последовательной обработкой ипритсодержащей массы сначала микроорганизмами, разрушающими связи C-Cl, а затем микроорганизмами, конвертирующими тиодигликоль (ТДГ) в гликолевые кислоты, в частности 2-оксиэтилтиогликолевую и/или тиодигликолевую.

Деструкцию связи C-Cl осуществляли с использованием микроорганизмов Pseudomonas doudoroffii шт. 70-11, Pseudomonas sp. шт 8-1, 8-2, 8-3; Corynebacterium sp. КЗБ или их ассоциатов, т.е. взятых в виде индивидуальных культур или их смесей в соотношении 1:1-1:2.

Лучшие результаты достигались при проведении деструкции при 20-30^oС (лучше 28^oС) на среде (pH 7.5-7.6), содержащей до 3,0 г/л иприта или его гидролизата и 7-40 г/л добавок неорганических солей в воде, например, (г/л): 3.0-5.0 (NH₄)₂SO₄, 1.0-2.0 K₂HPO₄, 1.0-2.0 KH₂PO₄, 0.1-0.3 MgSO₄, 0.01-30.0 NaCl.

Окисление ТДГ осуществляли с использованием в качестве микроорганизмов Gluconobacter oxydans или Pseudomonas sp. 8-2. При этом Ps.sp. шт. 8-2 и Gluconobacter oxydans вводили в качестве добавки в смесь, образовавшуюся в ходе деструкции, или раствор ТДГ в количестве 3-5 г/л при pH 6.5-7.5. Микроорганизмы вводят в дозе 10⁹-10¹⁰ кл/мл.

Преимуществом способа является более высокая скорость разложения по сравнению с химическим гидролизом, полная деградация ОВ, утилизация продуктов дехлорирования.

Наиболее эффективным является использование для биодеградации иприта штаммов Pseudomonas species шт. 8-2, Pseudomonas doudorofii шт. 70-11, Corynebacterium species шт. КЗБ.

Штамм 8-2 Pseudomonas sp. был выделен из почвы г. С.-Петербурга, депонирован в Коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии 11.03.96 в группе эпифитных микроорганизмов под регистрационным номером "ВНИИСХМ Д-602".

Штамм растет на СПА или на агаризованной среде следующего состава (г/л): тиодигликоль 3.0, глюкоза 5.0; дрожжевой экстракт 2.0; (NH₄)₂SO₄ 4.0; K₂HPO₄ 1.5; KH₂PO₄ 1.5; MgSO₄•7H₂O 0.2; агар-агар 20.0, вода остальное; при pH 7.0, температуре 28^oC.

При культивировании пигмент не образует, штрих на косячках агаризованной среды беловато-кремового цвета.

Клетки представляют собой на твердой среде палочки длиной 0.85-3.26 мкм и шириной 0.43-0.59 мкм. Спор не образует. Клетки подвижны, имеют жгутики на одном из полюсов. Микроорганизмы относятся к грамотрицательным.

Штамм хорошо растет на среде с аммонийным азотом, образует кислоту при росте на среде с глюкозой, галактозой, маннозой, ксилозой. Не образует кислоту на среде с сахарозой, лактозой, арабинозой, рамнозой, маннитом, фруктозой, дульцитом, инозитом.

Культура не образует индола и сероводорода, имеет положительный аэробный тест Хью-Лейфсона, каталозо- и оксидазоположительна, уреазоотрицательна, не обладает β-галактозидазной активностью. Желатину, крахмал и казеин не гидролизует. Дезаминирует фенилаланин. Способностью к денитрификации не обладает.

Штамм, как показали проведенные эксперименты, является деструктором хлорорганических соединений, в частности иприта.

Штамм Corynebacterium sp. КЗБ был выделен из почвы С.-Петербурга, депонирован в Коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии 11.03.96 в группе эпифитных микроорганизмов под регистрационным номером "ВНИИСХМ Д-604".

Штамм растет на СПА или на агаризованной среде следующего состава (г/л): тиодигликоль 3.0; глюкоза 5.0; дрожжевой экстракт 2.0; (NH₄)₂SO₄ 4.0; K₂HPO₄ 1.5; KH₂PO₄ 1.5; MgSO₄•7H₂O 0.2; агар-агар 20.0. pH 7.0. Температура 28^oC.

При культивировании пигмент не образует, штрих на косячках агаризованной среды беловато-кремового цвета.

На твердой среде клетки представляют собой палочки со средними размерами 0.75x2.3 мкм. Спор не образует, клетки неподвижны, жгутиков не имеют, грамположительны.

Штамм растет на среде с аммонийным и нитратным азотом, не использует органические источники азота. Образует кислоту при росте на среде с глюкозой, маннозой, сахарозой, маннитом, не образует кислоту на среде с галактозой, ксилозой, арабинозой, рамнозой, лактозой, фруктозой, дульцитом, инозитом.

Культура не образует индола и сероводорода. Имеет положительный аэробный и анаэробный тест Хью-Лейфсона, обладает β-галактозидазной активностью, каталозо-положительна. Желатину, крахмал, казеин не гидролизует, фенилаланин не дезаминирует, восстанавливает нитраты.

Штамм является деструктором хлорорганических соединений, в том числе иприта.

Штамм Pseudomonas doudoroffii шт. 70-11 был выделен из морской воды Балтийского моря, депонирован в Коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии 11.03.96 в группе эпифитных микроорганизмов под регистрационным номером "ВНИИСХМ Д-603".

Культура хорошо растет на СПА с 3% NaCl или на агаризованной среде следующего состава (г/л): тиодигликоль 3.0; глюкоза 5.0; дрожжевой экстракт 2.0; (NH₄)₂SO₄ 4.0; KH₂PO₄ 1.5; MgSO₄•7H₂O 0.2; K₂HPO₄ 1.5 NaCl 30.0; агар-агар 20.0. pH 7.0, температура 20^oC.

При культивировании пигмент не образует, штрих на косячках агаризованной среды беловато-кремового цвета.

На твердой среде клетки представляют собой палочки со средними размерами 0.5x1.3 мкм. Спор не образуют. Клетки подвижны, жгутикование - монополярный политрих. Грамотрицательны.

Культура растет на среде с аммонийным и нитратным азотом, гидролизует мочевину. Образует кислоту при росте на среде с глюкозой, маннозой, ксилозой, арабинозой, сахарозой и маннитом. Не образует кислоту на среде с лактозой, рамнозой, мальтозой, фруктозой, дульцитом, инозитом.

Не образует индола и сероводорода. Культура имеет положительный аэробный тест Хью-Лейфсона, каталозо- и оксидазо-положительна, β-галактозидазной активностью не обладает. Желатину, крахмал, казеин не гидролизует. Не дезаминирует фенилаланин. Восстанавливает нитраты.

Штамм является деструктором хлорорганических соединений, в том числе иприта.

Сущность изобретения и его практическая применимость иллюстрируется примерами.

Пример 1. 80 г иприта гидролизовали в 1000 мл воды при pH 11 в течение 4 ч. Полученный гидролизат, содержащий 0,56% хлорорганических веществ распада иприта (ХОС) и 7,2% тиодигликоля, добавляли в питательную среду (исходя из 40% от ее объема), содержащую микроорганизмы Pseudomonas sp. 8-1 и шт. 8-2 в соотношении 1:2 исходя из 10¹⁰ клеток/мл. Полученная среда содержала (г/л), тиодигликоль 28,8; ХОС 2,8; (NH₄)₂SO₄ 5,0; K₂HPO₄ 2,0; KH₂PO₄ 1,0; MgSO₄ 0,3. Вода остальное.

Смесь выдерживали в течение 9 сут при 28^oC и скорости перемешивания 180 об/мин. Период полураспада ХОС 2.2 сут, скорость дехлорирования 311 мг/сут. Степень утилизации органических веществ - 10,5%. Степень деградации ХОС 100%.

После завершения процесса в среду дополнительно вводили культуру Pseudomonas sp. 8-2 в дозе 0.4•10⁹ кл/мл и выдерживали в течение 6 сут при 28^oC.

Степень деградации тиодигликоля 96%.

Пример 2. В условиях примера 1 в среду, содержащую в 1 л; 12,9 г тиогликоля, 1,0 г хлорорганических веществ, 1,5 г K₂HPO₄, 4,0 г (NH₄)₂SO₄, 0,2 г MgSO₄•7H₂O; KH₂PO₄ 1,5 г, 0,01 г NaCl вводили 3•10⁹ кл/мл смеси в соотношении 1:1 Pseudomonas sp. 8-2 и 8-3, pH среды 7.5.

Смесь выдерживали 6 сут при 28^oC на роторной качалке при 230 об/мин.

Время полураспада составило 1.2 сут. Скорость дехлорирования 167 мг/сут. Прирост баомассы 180%, степень утилизации субстрата 52,8%.

Через 6 сут в среду добавляли культуру, содержащую 2•10¹⁰ кл/мл Gluconobacter oxydans, выращенную на среде, содержащей в 1 л 3,0 г сорбита, 0,3 г (NH₄)₂SO₄, 0,2 г дрожжевого автолизата, при pH 6.5 в течение 25 ч.

Степень конверсии тиодигликоля 100%.

Пример 3. В условиях примера 1 на среде, содержащей в 1 л воды 5,2 г ТДГ, 0,4 г ХОС, 3,0 г (NH₄)₂SO₄, 1,0 г K₂HPO₂, 2,0 г KH₂PO₄, 0,1 г MgSO₄ и смесь, содержащую смесь 1:1 микроорганизмов Pseudomonas sp. 8-2 и Corynebacterium sp. шт. КЗБ в общей дозе 10¹¹ кл/мл. Смесь выдерживали 5 сут при 28^oC и перемешивали (200 об/мин).

Время полураспада 0,9 сут. Скорость дехлорирования 80 мг/сут, степень утилизации субстрата 98%.

Пример 4. В условиях примера 3 при соотношении Pseudomonas sp. 8-2 и Corynebacterium sp. соответственно 2:1 и 1:2 при времени полураспада соответственно 0,8 и 0,9 сут скорости дехлорирования составили 92 мл/сут и 80 мг/сут.

Пример 5. В условиях примера 2 были проведены опыты при использовании вместо ассоциата индивидуальных штаммов Pseudomonas sp. шт. 8-2, Corynebacterium sp. шт. КЗБ и Ps. doudoroffii шт. 70-11 (последнюю культивировали при 20^oC и введении в среду 20-30 г/л NaCl).

Время полураспада составляло соответственно 1,3, 1,5, 6,1 сут.

Скорости дехлорирования 157, 149 и 51 мг/сут соответственно.

Пример 6. Культуру Gluconobacter oxydans, выращенную на среде, содержащей (г/л): 3,0 г сорбита, 2,5 г автолизата дрожжей, 0,3 г (NH₄)₂SO₄ в течение 20 ч, в дозе 3 г/л вводили в растворы, содержащие 2,0% CaCO₃ и от 0,2 до 10,0% ТДГ.

Время полной конверсии составило при 0,2% ТДГ 3 сут., 2% ТДГ 9 ч, 5% ТДГ 24 ч, 10% ТДГ 42 ч. Полученная смесь содержала 2-оксиэтитиоглюколевую и тиодигликолевую кислоты.

ЛИТЕРАТУРА.

1. Харечко А.Т. и др. Российский химический журнал, 1998, т. 37, N 3, с. 40-43.

2. Attaway H. , Nelson J.O. e.a. Appl. & Environ. Microbiol., 1987, v. 53, N 7, p. 1375-1382.

3. Kaaijk J., Frijlink C., Pestic. Sci., 1977, v. 8, N 4, p. 544-548.

4. Pensci E. C., TR-ARCSL-TR-83021.AD B07518L Aberdeen Proving Grouns, MD:US Army, Res.Devel.Command, 1983.

5. Small M.J., TR-8208 (AD-B077 091) Fort Detrick, MD:US Army Med.Res. Devel.Command., 1983.

6. Биологическая дегазация отравляющих веществ. Материалы конференции НИИ НАТО. Май 1991. М., 1991.

7. Арбисман Я.С. и др. Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Минск, 1998, т. 4, с. 8-9.2

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: предлагается способ биодеградации иприта, заключающийся в последовательной обработке ипритсодержащих смесей сначала микроорганизмами, разрушающими связь C-Cl, а затем бактериями, конвертирующими тиодигликоль в органические кислоты; одновременно предложены штаммы микроорганизмов Pseudomonas species шт. 8-2, Pseudomonas doudorofii шт. 70-11, Corynebacterium species шт. КЗБ, обладающие способностью к биодеградации иприта. 4 с. и 6 з.п. ф-лы.

1. Способ биодеградации ипритсодержащих смесей путем обработки их воздействием микроорганизмов при их культивировании на ипритсодержащих средах, отличающийся тем, что обработку смесей осуществляют последовательно микроорганизмами, вызывающими деструкцию связи углерод хлор, а затем микроорганизмами, утилизирующими тиодигликоль. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для деструкции связи углерод - хлор используют штамм бактерий Pseudomonas doudorofii 70-11 ВНИИСХМ Д-603, штамм бактерий Pseudomonas species 8-1, штамм бактерий Pseudomonas species 8-2 ВНИИСХМ Д-602, штамм бактерий Pseudomonas species 8-3, штамм бактерий Corynebacterium species КЗБ ВНИИСХМ Д-604 или их ассоцианты. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что обработку осуществляют при культивировании микроорганизмов при 20 30^oС на среде, содержащей до 3 г/л иприта или его гидролизатов и 7 40 г/л минеральных солей при pН 7,5 - 7,6. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве минеральных солей используют смесь, содержащую (NH₄)₂SO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄, NaCl при следующем соотношении компонентов, г/л:
(NH₄)₂SO₄ 3 5
K₂HPO₄ 1 2
KH₂PO₄ 1 2
MgSO₄ 0,1 0,3
NaCl 0,01 30,0
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что для утилизации тиодигликоля смесь обрабатывают штаммом бактерий Pseudomonas species 8-2. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для утилизации тиодигликоля смесь обрабатывают микроорганизмом Gluconobacter oxydans. 7. Способ по любому из пп.1 6, отличающийся тем, что микроорганизмы вводят в дозе 10⁹ 10^1 1 кл/мл. 8. Штамм бактерий Pseudomonas species 8-2 ВНИИСХМ Д-602 биодеградатор иприта. 9. Штамм бактерий Pseudomonas doudorofii 70-11 ВНИИСХМ Д-603 - биодеградатор иприта. 10. Штамм бактерий Corynebacterium species КЗБ ВНИИСХМ Д-604 - биодеградатор иприта.