Способ определения производных бензимидазола в биологических объектах Советский патент 1985 года по МПК G01N30/94 

1

Изобретение относится к санитарии и фармакологии и может быть использовано для санитарно-гигиенической оценки продуктов животноводства после применения метш1-Ы-(2-бен9имидазолил)карбамата (БМК) и фенбендазола в качестве лечебных препаратов и разработки рациональных методов терапии животных при гельминтознбпс заболеваниях.

БМК структурной формулы

N

кн-со-осн.

659842

дования и включает использование метанола - высокотоксичного вещества, для работы с которьм необходимо специальное разрешение. 5 Известен также способ определения производных бензимидазола - 6ена:цила и БМК в тканях животного происхоадения спектрофотометрическим методом. Способ основан на извлече0 НИИ бенацила и БМК из проб хлороформом, отделении препаратов от мешающих примесей 10%-ным раствором серйой кислоты и последующем спектрофотометрировании проб при двух длинах волн - 281 и 295 нм. Чувствительность метода 0,5 мг/кг 2j.

Недостатками способа являются низкая чувствительность определения БМК, необходимость параллельного исследования контрольных проб (аналогичных тканей, не содержащих БМК) и недостаточная очистка экстрактов. Наиболее близким по технической

5 сущности к изобретению является

Хроматографический метод определения остаточных количеств арилата (бенлата) по БМК в растительных объектах, почве и воде. Способ основан на извд лечении БМК из анализируемого объекта этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в солянокисл5то среду, а Затем после подщелачивания, в этипацетат с последующим определением методом тонкослойной хроматографии в системе подвижных растворителей этилацетат-хлороформ-ледяная уксусная кислота (50:50:10) на пластинах Силуфол УФ-254. Чувствительность способа 0,2 мг/кг (10 мкг в пробе) для oгypцoвJ 0,3 мг/кг (10 мкг в пробе) для яблок и 0,75 мг/кг (15 мкг в пробе) для поч1ы. Процент определения составляет 70-90 З J,

5 Недостатками известного способа являются низкая чувствительность определения (10-15 мкг препарата в пробе), невозможность его применения для определения фенбендазола 0 и БМК в тканях животных из-за недостаточной очистки экстрактов и использования больших количеств этилацетата (350 мл на одну пробу).

Цель изобретения - повьшгение 5 чувствительности, точности и специфичности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве органического растворителя в процессе экстракции используют хлороформ или эфир, очистку от коэкстрактивных веществ осуществляют на колонке с окисью алюминия смесью эфира и ацетона .в соотношении 2:1-1:2 с последующей элюцией производных бензимидазола хлороформом. Для обеспечения возможности дополнительного определения фенбен дазола хроматограммы после облзгче.ния ультрафиолетовым светом обраба тывают свежеприготовленной смесью 2,5%-ного раствора трёххлористого железа в 50%-ном водном ацетоне и 0,25%-ного раствора калия тексацианоферрата III в 50%-ном водном ацетоне в соотношении 3:1-1:5 с последующим нагреванием пластин при 90-1Ю С до появления пятен препарата голубой окраски. При экстрагировании выявляемых препаратов ; из биологических объектов одновременно извлекается большое количество коэкстрактивных веществ (жиры, пигменты), которые мешают при конечном определении препаратов тонкослойной хроматографией. Для удаления коэкстрактивных веществ проводят упаривание экстрактов , сухой остаток смывают небольшим количеством эфира, не допуская конденсации воды, и вносят в хроматографическую коло ку. Колонку наполняют последовател но безводным сернокислым натрием высотой 1 см, окисью алюминия высо той 1,5 см и слоем безводного сернокислого натрия высотой 1 см. Для увеличения скорости потока элюирукмцих растворов, через колонку при очистке экстракта в качестве адсор бента используют окись алюминия с размером частиц 80-125 меш. Очистка экстрактов от примесей основана на том, что фенбендазол и БМК адсорбируются на окиси алкя4и и не элюируются определенным количеством смеси эфира и ацетона, кото рая в то.же время хорошо злюирует коэкстрактивные вещества. При испол зовании колонки с указанными парам рами используют 10 мл смеси эфира и ацетона в соотношении 2:1-1,:2. П ле удаления коэкстрактивных вещест препараты вымывают из колонки 25 30 мл хлороформа. Эфир-ацетоновый элюент отбрасывают, а хлороформный упаривают до объема 0,2-0,3 мл и 844 наносят на хроматографическую пластину Силуфол УФ-254. После развития хроматограммы в системе подвижньж растворителей пятна препаратов выявляют в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Фенбендазол и БМК обнаруживают в виде сиреневых пятен на зеленом флуоресцирующем фоне. Кроме того, для определения фенбендазола используют свежеприготовленную сме.сь 2,5%-ного раствора трёххлористого железа в 50%-ном водном-ацетоне и 0,25%-ного раствора калия гексацианоферрата III в 50%ном водном ацетоне в соотношении 3:1-1:5. После опрыскивания пластин их выдерживают при 90-110 С до появления голубых пятен фенбендазола на желто-зеленом фоне. Pf фенбендазола в системе подвижных растворителей хлороформ-этанол (20-1) составляет 0,35-0,45,- БЖ 0,45-0,55. Поэтому для достоверного дифференцирования их между собой проводят дополнительное опрыскивание пластин смесью растворов трёххлористого железа и калия гексациа- ноферрата III. При этом фенбендазол проявляется в виде голубых пятен на желто-зеленом фоне после нагревания пластин, а БМК, в отличие от фенбендазола, данным реактивом не проявляется. Оптимальные результаты при обнаружении пятен фенбендазола получают при опрыскивании.пластин смесью 2,5%-ного водно-ацетонового раствора трёххлористого железа и 0,25%-ного водно-ацетонового раствора калия гексацианоферрата III в соотношении 3:1-1:5. Способ осуществляют следукяцим образом. Пример 1. Навеску 10 г мяса, 5 г печени, 5 г жира, 10 г почек измельчают, помещают в коническую колбу емкостью 100-200 см, заливают 15-20 мл хлороформа или эфира и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 1 ч. Затем хлороформный или эфирный экстракт фильтруют через ватный фильтр в фарфоровую чашку. К пробе повторно добавляют 10-15 мл хлороформа или эфира, встряхивают 30 мин и фильтруют через тот же фильтр к первой порции растворителя. Объединенный экстракт упаривают на водяной бане при 6080 С. Сухой остаток смывают эфиром двукратно порциями по 2-3 мл и вно5 . сят в стеклянную колонку с внутрен ним диаметром 8-9 мм, содержащую 1,5-сантиметровый слой окиси алюми Ния для хроматографии, заключенный между слоями безводного сернокисло го натрия по 1 см. После прохождения экстракта через колонку проводят удаление коэкстрактивных веществ. Пример 1а, Колонку промыв ют смесью эфира и ацетона в соотно шении 2:1 в количестве 10 мл. При обнаружении фенбендазола и БЖ в ультрафиолетовом свете на пластине обнаруживают крэкстрактив ные вещества, которые затрудняют выявление и количественную оценку препаратов. Пример 1б (оптимальный вариант). .Колбнку промывают смесью эфира и ацетона в соотношении 1:1 в количестве 10 мл. При обнаружении препаратов в ультрафиолетовом свете сиреневые пятна фенбендазола и БМК четко вьщеляются на зеленом флюоресцирут кицем фоне пластины. Пример 1в. Колонку промывают смесью эфира и ацетона в соот ношении 1:2 в количестве 1О мл. При обнаружении препаратов.в ультрафиолетовом свете на пластине обнаруживают коэкстрактивные вещества, затрудняющие идентификацию препаратов. Полученный элюент отбрасывают и препараты вымывают из колонки 25-30 мм хлороформа, который собирают в фарфоровую чашку. Хлороформ ный элюент упаривают до объёма 0,2-0,3 мл и наносят на хроматогра фическую пластину Силуфол УФ-254. Рядом с пробой на пластину наносят известные количества фенбендазола и БЖ в хлороформе (стандарты). Пластину помещают в камеру со смесь подвижных растворителей хлороформэтанол (20:1). После прохождения растворителей пластину высушивают на воздухе и облучают ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм При этом фенбендазол и БЖ обнаруживают в виде темно-сиреневых пяте на зеленом флуоресцирующем фоне пл тины. Количество препарата в пробе оп ределяют путем сравнения интенсивн ти окраски и площади пятен пробы и 846 стандартных растворов, используя следующую формулу: А S2 К зГр где X - общее количество фенбендазола и/или БЖ, мг/кг; А - количество фенбендазола и/или БЖ в стандартном растворе, нанесенном на пластину, мкг -, S, - площадь; пятна стандартного раствора фенбендазола и/или ВЖ, мм J S - площадь пятна фенбендазола и/или БЖ из исследуемой пробы, мм J К - коэффициент пересчета, учитывающий полноту определения фенбендазола (1,264) и ШК (1,261), Р - масса исследуемой пробы, г. Пример 2. Навеску 10 г мяса, 5 г печени, 5 г жира, 10 г почек измельчают,помещают в коническую колбу емкостью 100-200 см, заливают 115-20 мл хлороформа или эфира и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 1 ч. Затем хлороформный или эфирный экстракт фильтруют через ватный фильтр в фарфоровую чашку. К пробе повторно добавляют 1015 мл хлороформа или эфира, встряхивают 30 мин и фильтруют через тот же фильтр к первой порции растворителя, Объединенный экстракт упаривают на водяной бане при 60-80°С. Сухой остаток смывают эфиром двукратно порциями по 2-3 мл и наносят на стеклянную колонку свнутренним диаметром 8-9 мм, содержащую 1,5сантиметровьй слой окиси алюминия для хроматографии, заключенный между .СЛОЯМИ безводного сернокислого натрия по 1 см. После прохождения экстракта через колонку проводят удаление коэкстрактивных веществ. Для этого колонку промывают смесью эфира и ацетона в соотношении 1:1 в количестве 10 мл. Полученный элюент отбрасывают и препараты вымывают из колонки 25-30 мл хлороформа, который собирают в фарфоровую чашку. Хлороформный экстракт упаривают до объема 0,2-0,3 мл и наносят на хроматографическую пластину Силуфол УФ-254 i Рядом с пробой на пластину наносят известные количества фенбендазола и БЖ (стандарты). Пластину прмещают в камеру со смесью подвижных растворителей хлороформ Этанол (20:1). После прохождения р ворителей пластину высушивают на воздухе и облучают ультрафиолетовы светом с длиной волны 254 им. При этом фенбендазол и БМК обнаруживаю в виде темно-сиреневых пятен на зеленом флуоресцирующем фоне пластины. Флуоресцирующие на пластине пятна фенбендазола и ВМК из стандарных растворов и исследуемой про бы обводят по периметру простым карандашом, пластину опрыскивают свежеприготовленной смесью 2,5%-но раствора треххлористого железа в 5 ном водном ацетоне и 0,25%-ного раствора калия гексацианоферрата I в 50%-ном водном ацетоне в ;соотно1п шении 3:1-1:5 и выдерживают при 90-110 с до появления .пятен фенбен дазола . : Пример 2а. Пластину опры кивают проявляняцим реактивом при соотношении компонентов 3:1. Фенбендаэол выявляют в виде бледно-голубого пятна на светлом желто-зеленом фоне. Пример 26 (оптимальный вариант). Пластину опрыскивают проявляющим реактивом при соотношении компонентов 1:1. Фенбендазол выявляют в виде интенсивного голубого пятна на светлом желто-зеленом фоне. Пример 2в. Пластину опрыскивают проявляющим реактивом при соотношении компонентов 1:5.

Объект иссле- Навеска, :дования 848 Фенбендазол выявляют в виде бледного голубого пятна на светлом желто-зеленом фоне. Количественную, оценку фенбандазола проводят, как указано. В таблице представлены результаты определения количеств фенбендазола и БМК при добавлении их к исследуемым объектам. Чувствительность предлагаемого способа составляет 0,5 мкг фенбендазола и 1 мкг БМК в нанесенной на -пластину пробе или для фенбеидазола в мясе и почках 0,05 мг/кг, в печени и жире 0,1 мг/кг} для БЖ в мясе и почках 0,1 мг/кг, в печени и жире 0,2 мг/кг. Процент определения равен для фенбендазола 79,1.+2,2-, для БМК 79,3t1.1. Предлагаемый способ дает возможность осуществлять контроль за чистотой продуктов животного происхождения после применения фенбендазола и БЖ с лечебной и профилактической целью. Он обладает высокой чувствительностью, точностью, специфичностью и позволяет определять одновременно два препарата в орга- . нах и тканях животных. Повышение чувствительности предлагаемого способа имеет з.начение при санитарной оценке продуктов животноводства, так как фенбендазол и БЖ на уровиях ниже чувствительности известного способа сохраняются в биологических объектах длительное время.

1. СПОСОБ ОПРЕЛЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, включающий экстракцию его органическим растворителем, очистку экстракта от коэкстрактивных веществ, упаривание экстракта, хроматографирование на пластинах Силуфол УФ-254 и идентификацию производных бензимндазола путем облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм, отличающийс я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, в качестве органического растворителя в процессе экстракции используют хлороформ или эфир, очистку от коэкстрактивных веществ осуществляют на колонке с окисью алюминия смесью эфира и ацетона в соотношении 2:11:2 с последующей элюцией производных бенэимидазола хлороформом. 2. Способ по п. 1,отличаю щ и и с я тем, что, с целью повышения специфичности способа путем обеспечения возможности дополнительного определения фенбендазола в био(Л логических объектах, хроматограммы после облучения ультрафиолетовым светем обрабатывают свежеприготовленной смесью 2,5%-ного раствора треххлористого железа в 50%-ном водном ацетоне и 0,25%-рого раствора калия гексацианоферрата III в Сд 50%-ном водном ацетоне в соотношеел нии 3:1-1:5 с последующим нагреванием пластин при 90-110 С до появления пятен препарата голубой окраски. |i