Штамм бактерий JeRSINIa реSтIS, используемый для контроля цепи синтеза L-аргинина на этапе образования L-аргининосукцината Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12N15/01 C12Q1/00 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к генетике чумного микроба, и касается нового штамма бактерий Yersinla pestls, который может бть использован в качестве эталонного объекта для контроля генетического повреждения гена L-аргининосукцинат- синтетазы и изучения пути биосинтеза аргинина.1

Цель изобретения - получение безопасного в работе, авирулентного штамма чумного микроба Yerslnia pestls ВНИПЧИ Микроб ЕУ КМ-224 arg с генетическим

повреждением гена, контролирующего синтез L-аргининосукцинатсинтетазы.

Штамм Yersinia pestls КМ-224 arg является производным вакционного штамма ЕУ-76 линии НИИЭГ. Получен при помощи химического мутагенеза М-метил-М-нитро- N-нитрозогуанидином с последующей селекцией пенициллиновым способом.

Оптимальные условия хранения штамма: 1) в лиофилицированном состоянии при температуре от -20 до 4° С; 2) на скошенном агаре Хоттингера при периодических пересевах через 1,5-2 мес.

О

о

ю о -ч

Штамм имеет следующую характеристику.

Культура л ьно-морфологические признаки.

Полиморфные грамотрицательные палочки (0,4x0,9 мкм). В мазках из бульонных культур встречаются биполярно окрашенные клетки, расположенные цепочкой. На поверхности агара Хоттингера (рН 7,1) культура штамма формирует колонии в Р-форме с типичной для чумного микроба морфологией. В бульоне культура штамма дает придонный агглютинативный рост в виде хлопьев среда при этом остается прозрачной.

Физиолого-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода. Сбраживает с образованием кислоты без аза глюкозу, мальтозу, маннозу, маннит, алактозу, арэбинозу и не сбраживает сахарозу, дулыцит, сороит, лактозу, рамнозу, яицерин.

Отношение к источникам азота. Используют аммонийный и аминный азот в составе аминокислот рост возможен рН «,5-8,5. Оптимальный рН 7,0-7,2.

Пп.,-, В° С синтезирует пестицин, фиб- -мнолизин и плазмокпагулазу, на среде с гемином образует непигментированные колонии; при 37° С синтезирует антиген - фракцию 1. При подкожном введении 1х106 микробных клеток EV KM-224 arg гибели лабораторных животных не вызывает.

Лизируется фагами: чумным диагностическим Л-413, Т-7 и Д.Эрреля.

Штамм Yersinla pestis EV KM-224 arg ауксотроф. Кроме L-аргининосукцината или 1 -аргинина для своего роста и размножения при 28° С на синтетической среде М-9 нуждается в L-метионине и L-фенилаланине.

Особенностью является искусственно введенная в геном мутация, которая повреждает фермент превращения цитруллм- на в присутствии АТФ и аспартата в 1 -аргининосукцинат-1 -аргининосукцинатс- интетазу: В фенотипе это свойство проявляется ауксотрофностью по L-аргинину с возможностью замены последнего L-аргининосукцинатом. На синтетических Средах с необходимыми L-метионином, L- фенилаланином, треонином, L-цистеином и L-аргининосукцинатом (натриевая или калиевая соли) при 28° С через 4-6 сут культура штамма образует светлые колонии размером до 1,5 мм. На средах без аргининосук- цината, но содержащих цитруллин - непосредственный предшественник синтеза L-аргининосукцината, и аспартат, рост культуры штамма отсутствует при высевах от 1x101 до 1x109 клеток. Это свидетельствует о том, что клетки штамма не способны осуществлять ферментативное превращение цитруллина до аргининосукцината. Этот генетический признак стойко наследуется - уровень спонтанной реверсии к про- тотрофности по признаку не превышает .. Штамм высокоспецифичен и не растет в присутствии L-форм других аминокислот.

0 Пример. Использование штамма Y. pestis E V KM-224 arg в качестве тест-штамма при контроле блока биосинтеза аргинина у природных (или индуцированных) аргинин- зависимых ауксотрофов с неизвестным

5 уровнем генетического повреждения.

1.Подготовка питательных сред. К остывающей питательной среде М-9 добавляют (из расчета на 1 л) стерильные растворы 10%-ного сульфата магния 10 мл, по 1 мл

0 1%-ного растворов аминокислот в L-форме (фенилаланина и метионина, треонина, цис- теина, лейцина изолейцина, тирозина, триптофана, глицина, валина). Группа контрольных сред (1-я группа) не содержит пред5 шественников синтеза аргинина. В опытные среды вносят до 10 мкг/мл L-цит- руллина (2-я группа). L-аргининосукцината (3-я группа) и L-аргинин (4-я группа).

2.Подготовка культур. Культуры Y. 0 pestis EV KM-224 arg и параллельно исследуемых штаммов выращивают на поверхности пластинок агара Хоттингера (рН 7,1-7,2) в течение 24-48 ч при 28° С. Готовят бактериальные взвеси в забуференном физиоло5 гическом растворе (рН 7,1) плотностью 1x10 клеток на 1 мл и по 0,1 мл высевают на поверхность синтетических питательных сред. Посевы инкубируют при 28° С в течение 3-5 сут.

0 Предлагаемая в качестве тест-штамма культура Y.pestis EV KM-224 arg на контрольной среде (1-я группа) и среде с цитрул- лином (2-я группа) не вырастает, так как ее клетки не могут осуществлять процесс обра5 зования L-аргининосукцината из цитрулли- на. В то же время на опытных средах с L-аргининосукцинатом (3-я группа) и L-аргинином (4-я группа) штамм обнаруживает четкий рост.

0Если исследуемые штаммы дают идентичный характер роста на питательных средах, т.е. вырастают на средах с L-аргининосукцинатом и L-аргинином, то можно сделать вывод о повреждении гена,

5 контролирующего аргининосукцинатсинте- тазу.

В тех случаях, когда исследуемые штаммы, как и тест-штамм дают рост только ня питательных средах с L-аргинином (4-я группа), но не на средах с предшественниками

(L-аргининосукцинатом, L-цитруллином) можно сделать заключение о том, что имеет место повреждение L-аргининосукцинатли- азы, осуществляющей превращение L-арги- ниносукцината в L- аргинин.

Предлагаемый штамм может быть использован как эталонный объект для контроля генетического повреждения гена L-аргининосукцинатсинтетазы при сравнительном анализе индуцированных аргинин- зависимых мутантов вирулентных штаммов

0

или выделенных в природных очагах чумы, а также может служить в качестве тест- штамма для контроля ростовых свойств пи- тательных сред (как полных так и синтетических) при работах со штаммами возбудителя чумы.

Формула изобретения Штамм бактерий Yersinia pestls ВНИП- ЧИ Микроб EY КМ-224 arg, используемый для контроля цепи синтеза L-аргинина на этапе образования L-аргининосукцината.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к генетике чумного микроба, и касается нового штамма бактерий JERSINIA PESTIS, который может быть использован в качестве эталонного объекта для контроля генетического повреждения гена L - аргининосукцинатсинтезы и изучения пути биосинтеза аргинина. Целью изобретения является получение безопасного в работе, авирулентного штамма чумного микроба JERSINIA PESTIS ВНИПЧИ "Микроб" Е 4 КМ - 224 ARG^- с генетическим повреждением гена, контролирующего синтез L - аргининосукцинатсинтетазы. При выращивании на среде М - 9 с добавлением L-метионина и L-фенилаланина, но без добавления предшественников синтеза аргинина и той же среде с цитруллином штамм не растет. На той же среде с добавлением L-аргининосукцината и L-аргинина штамм обнаруживает четкий рост.