Способ подготовки гистологического препарата для выявления нервных волокон на срезах ткани Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно - к морфологии и может применяться при проведении морфогисто- химических исследований для выявления нервных волокон в парафиновых срезах ткани.

За прототип предлагаемого способа выбран известный способ выявления нервных волокон в парафиновых срезах ткани, включающий фиксацию материала раствором.

содержащим формалин, импрегнацию срезов 20% раствором нитрата серебра и обесцвечивание фона 0,1% раствором хлорного золота.

В полном виде, поскольку процесс подготовки кусочка ткани к заливке в парафин одинаков (стандартен) для любого дальнейшего,, способа окраски, способ-прототип и предлагаемый способ включают в себя следующие этапы:

00

со ел ел

ю

Использование: в медицине, а именно в гистологии и патологической анатомии, и может применяться для выявления нервных волокон в парафиновых срезах ткани. Сущность изобретения: проводят фиксацию ткани, изготовление парафиновых срезов, импрегнацию среза 10-20% раствором нитрата серебра с последующим обесцвечиванием фона среза 0,1% раствором хлорного золота, обезвоживанием и заключением в бальзам. При этом фиксацию исследуемой ткани проводят 10% раствором нейтрального формалина в течение 2 суток, а импрегнацию осуществляют накалыванием 10-28% раствора нитрата серебра на-срез в количестве 0,5-1,0 мл с инкубацией при t - 37°С в чашках Петри в течение 60-120 мин с последующим обесцвечиванием фона среза нака- пыванием раствора хлорного золота в количестве 0,5-1,0 мл в чашке Петри. Способ позволяет снизить токсичность метода путем исключения использования пиридина, упростить способ, сэкономить дорогостоящие реактивы и сократить время импрегнации, 1 ил. Ё

Способ-прототипПредлагаемый способ

Фиксация:

Жидкость Лилли. 100 мл, 4-12 ч.Формалин 10%, 100 мл, 12- 48 ч

Промывка в водопроводной воде 2-6 ч 6-24 ч

Изготовление парафиновых блоков:

50 мл. Зч 50 мл, 3 ч 50 мл, 15 мин

ие ине

та

ь

лин

Импрегнация:

20 мин 1-6 ч

2-4 ч 40 мин

20-30 мл, 12 ч 60 мл, 15 25-30 мл, 2

60мл, 15

20 мл, 1 мин 20 мл, 2 мин

20 мл, 1 ч

20 мл, 10 мин 20 мл, 10 мин

25-30 мл, 15 мин 20 мл, 1 мин 20 мл, 5 мин

20 мин

Представляя сравнение двух способов по расходу реактивов и затраченному времени, автор считает необходимым дополнить следующее. По литературным данным и из практики хорошо известно, что наименьшее время фиксации - 12 ч, а минимальное время промывки - 6 ч. В предлагаемом способе также можно фиксировать 12ч, промывать после фиксации 6 ч. но исходя из практических соображений, в частности 7-часового рабочего дня лаборан

1 11

100 мл, 1 ч 100мл, 1 ч 100мл, 1 ч 100 мл, 1 ч 100 мл, 1 ч

100мл, 1 ч 100 мл. 1 ч 100 мл, 1 ч 100мл, 1 ч

50 мл, 1 ч

50 мл, 3 ч

. 50 мл, 3 ч

50мл, 15 мин

Депарафинирование 20 мин 20% р-р нитрата серебра-1 мл, 1-2 ч

1% кислый формалин 60мл, 15 мин аммиакат серебра-. 1 мл, 2 мин

0,5% кислый формалин60мл, 15 мин

:

20 мл, 1 мин 20 мл, 2 мин

20 мл, 1ч 20 мл, 5 мин 20мл, 10 мин

1 мл, 15 мин 20 мл, 1.мин 20 мл, 5 мин

20 мин

та-гистолога, целесообразно удлинить время на этих этапах так, как указано в заявке, без ущерба для результата импрегнации. В способе-прототипе указывается чистое время методики, без учета по крайней мере трех перерывов между рабочими днями (36 ч). Т.о., полное время обработки кусочка ткани от забора материала до заключения в бальзам в способе-прототипе наименьшее 40 ч (+36 ч), наибольшее - 53 ч (+36 ч). Время импрегнации наименьшее 24 ч 10 мин.

наибольшее -- 37 ч 10 мин. В предлагаемом способе полное время обработки наименьшее - 37 ч, наибольшее - 82 ч 5 мин. Время импрегнации наименьшее - 3 ч 55 мин, наибольшее А ч 55 мин. Очевидно, что в предлагаемом способе затраченное время меньше.

Из представленного сравнения также видно, что в обоих случаях гистологический материал подвергался одним и тем же этапам обезвоживания, уплотнения и заливки в парафин, и, что соответственно, расход таких реактивов как спирт, хлороформ, ксилол, парафин одинаков. Но на этапах импрегнации при прочих равных условиях, такие дорогостоящие реактивы как нитрат серебра и золотохлористоводородная кислота в предлагаемом способе используются в 25-30 раз меньше. При стоимости золото- хлористоводородной кислоты 565-00 руб/кг и нитрата серебра 148-00 руб/кг это достаточно экономично.

Упрощение предлагаемого способа заключается в том, что процесс импрегнации не зависит от подготовительных этапов от фиксации до заливки в парафин и может быть применен на архивном материале, т.е. парафиновых блоках, приготовленных много раньше. Кроме того, за счет исключения токсичного вещества, не требуется специального оборудования и средств защиты, необходимых при работе с ядовитыми веществами..

Неудобство способа-прототипа состоит также в том, что предлагаемая фиксация требует специального приготовления жидкости Лилли. Особенно нежелательным является использование пиридина/ представляющего собой токсичное, раздражающее и фотосенсибилизирующее вещество, вызывающее воспаление кожи с сильным жжением и образованием трещин. Кроме того, проведение импрегнации в биологических стаканчиках требует частой смены реактивов после .4-6 стекол, что увеличивает расход таких дорогостоящих реактивов, как азотнокислое серебро и хлорное золото.

Целью предлагаемого изобретения является снижение токсичности способа пуем исключения использования пиридина, упрощение способа, экономия дорогостоящих реактивов, сокращение времени и возможность импрегнировать архивный маериал.

Поставленная цель в способе подготовки гистологического препарата для выявлеия нервных волокон на парафиновых резах ткани, включающим фиксацию материала раствором, содержащим формалин, мпрегнацию среза 20% раствором нитрата

серебра и обесцвечивание фона 0.1% раствором хлорного золота, достигается тем. что фиксацию проводят 10% раствором нейтрального формалина в течение 2 суток, 5 импрегнацию - раствором нитрата серебра проводят в закрытых чашках Петри с инкубацией в термостате при 37°С (т.н. влажная камера) в течение 60-120 мин, обесцвечивание проводят путем создания такой же

10 влажной камеры с использованием 1 мл 0,1% раствора хлорного золота.

Предлагаемый способ имеет 5 отличительных от прототипа признаков. Все отличительные признаки существенны для

5 достижения поставленной цели - ликвидация или замена какого-либо признака приведет к изменению положительного эффекта. Это доказано экспериментально. Первый отличительный признак - про0 ведение фиксации в 10% растворе нейтрального формалина в течение 2 сут. В прототипе фиксацию проводят в жидкости . Лилли. Вообще применения 10% нейтрального формалина для парафиновых срезов

5 нервной ткани в доступной нам литературе не обнаружено. Полученные нами результаты показали, что фиксация в 10% нейтральном формалине в течение 2 сут вполне достаточна и дает хорошие результаты имп0 регнации.

Второе отличие предлагаемого способа заключается в том, что импрегнацию серебром проводят в плотно закрытых лейкопластырем чашках Петри (т.н. влажная

5 камера) в термостате при 37°С в течение 60-120 мин. Инкубацию проводят в 20% растворе нитрата серебра при 37°С в термостате, в чашках Петри, накалыванием реактива на срез (0,5-1,0 мл). Концентрация

0 реактива выбрана как наиболее часто рекомендованная другими авторами. Время и условия инкубации подбирались эмпирически.

5 В процессе поиска оптимальных результатов проводилась инкубация срезов от 30 мин до 48 ч. Полученные результаты показали, что оптимальный результат инкубации 60-120 мин. В нашем случае технически

0 удобнее было проводить инкубацию в течение 60 мин.

Третье отличие способа заключается в том, что обесцвечивание проводят путем создания т.н. влажной камеры с использоаа5 нием 1 мл раствора хлорного золота (В чашках Петри, реактив накапывается в количестве 0,5-1,0 мл на срез).-В прототипе этот этап проводится путем погружения предметных стекол со срезами в биологические стаканчики с реактивом (25-30 мл).

Необходимость использования в предлагаемом способе именно такого порядка доказана экспериментально. В данном способе идет последовательно фиксация забранного материала, выявление нервных волокон путем импрегнации, закрепление результата импрегнации, получение контрастного препарата за счет воздействия на остальные тканевые структуры и приготовление постоянного препарата. Изменение порядка окраски приводит как правило к полному отсутствию результата, реже - к значительному его ухудшению.

Положительный эффект способа заключается в снижении токсичности за счет исключения использования пиридина, экономии таких дорогостоящих реактивов как нитрат серебра и золотохлористоводород- ная кислота в25-30 раз; упрощении способа за счет исключения применения специаль- ного стеклянного инструмента; сокращения времени импрегнации с 24 ч 10 мин до 3 ч 55 мин; возможности работы с архивным материалом.

Изобретение осуществляется следую- щим образом. Пример дан в виде выписки из протокола эксперимента от 27 февраля 1990 года № 6. Импрегнировался архивный материал от 12.05.80 г, Экспериментальное животное - собака, самка, вес - 15,5 кг. Забор материала (жизненноважные органы) проводился после эфирно-кислородного наркоза. Материал фиксировался в 10% нейтральном формалине в течение 2 суток с последующей заливкой в парафин. С пара- финового блока стенки и папиллярной мышцы миокарда на санном микротоме была сделана серия срезов толщиной 3-7 мкм. Срез наклеивался на предметное ртекло, подсушивался и импрегнировался. Для этого срез депарафинировался по общепринятой методике, помещался в дистиллированную воду на 2 мин, затем помещался в чашки Петри, где на срез накапывался 20% раствор нитрата серебра. После этого чашки Петри заклеивались лейкопластырем и помещались в термостат для инкубации на 60-120 мин при 37°С. Затем стекло со срезом проводилось через 3 порции 1 % кислого формалина до полного отхождения мути. После чего срез помещали в чашках Петри, заклеенных лейкопластырем, в раствор аммиаката серебра, накапанный на срез, на 2 мин. Проводили через несколько порций 0,5% кислого формалина, останавливали импрегнацию в аммиачной воде, дифферзн- цировали тканевые структуры в 2% растворе надсернокислого аммония, прекращали процесс дифференцировки в 7% растворе сернистокислого натрия, тщательно отмывали в дистиллированной воде. Обесцвечивали фон среза в 0,1% растворе хлорного золота. Реактив накапывали на срез и помещали стекло в чашки Петри, заклеенные лейкопластырем. Восстанавливали серебро в 5% растворе гипосульфита 1 мин. Тщательно отмывали срезы в дистиллированной воде по общепринятой методике. Обезвоживали и заключали в бальзам также по общепринятой методике.

На полученном препарате при послойном описании под эпикардом видна четко просматриваемая поперечно-полосатая ис- черче.чность (серый фон).-Хорошо видна капиллярная сеть за счет прокрашивания эритроцитов; по форме находящихся в микрососудах эритроцитов определяется просвет капилляров. Нервных волокон немного, короткие, слегка извилистые, располагаются параллельно капиллярам и кардиомиоци- там. В интрамуральном слое нервные волокна прослеживаются с трудом, очень короткие, сравнимы с диаметром эритроцитов, тонкие. Более длинные и более крупные нервные волокна как бы опоясывают группы мышечных волокон. Ближе к эндокарду располагаются вдоль поперечного среза мышечных волокон. Интенсивно прокрашенные, извилистые. Под эндокардом: поперечно-полосатая ичерченность менее четкая, капиллярная сеть прослеживается хорошо. Эритроциты округлой формы, свободно лежащие. Нервные волокна располагаются вдоль кардиомиоцитов (см. чертеж), а также в пространстве между несколько разволокненными миофибриллами и в поперечном направлении по отношению к кар- диомиоцитам.

Предлагаемый способ был применен для исследования влияния ишемии на мор- фогистохимию нервных волокон миокарда. Исследовались 32 препарата, сделанных с архивного материала.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что предлагаемый способ имеет большие преимущества и может широко использоваться в экспериментальной медицине и биологии. Может быть использован для архивного материала, залитого в парафин. Не требует применения специальных стеклянных инструментов, что значительно облегчает работу лаборанта. Исключает работу с ядовитым реактивом, экономит дорогостоящие реактивы. Значительно сокращает время окраски.

Формула изобретения

Способ подготовки гистологического препарата для выявления нервных волокон на срезах ткани путем ее фиксации, изготовления парафиновых срезов, импрегнации

среза 20%-ным раствором нитрата серебралина в течение 2 сут, а импрегнацию осущес последующим обесцвечиванием фона ере-ствляют нанесением 20%-ного раствора

за 0,1%-ным раствором хлорного золота,нитрата серебра в виде капель на срез в

обезвоживанием и заключением в бальзам.. количестве 0,5-1,6 мл с инкубацией при

отличающийся тем, что, с целью5 37°С в чашках Петри в течение 60-120 мин

упрощения способа и сокращения временис последующим обесцвечиванием фона среисследования, фиксацию ткани проводятза раствором хлорного золота в количестве

10%-ным раствором нейтрального форма-0,5-1,0 мл в чашке Петри,