СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВ Советский патент 1971 года по МПК C12P21/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известен способ получения протеинов путем выращивания микроорганизмов, нанример Arthrobacter, Corynebacterium, Pseudomo-nas aerugJnosa, Candida lipolytica, Aspergillus oryzae, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводороды, например керосин, в присутствии водной минеральной среды, стимуляторов роста и кислорода. Однако при получении протеина известным способом протеин накапливается в клеточных телах, а для его извлечения необходимо восстанавливать клеточные тела и затем подвергать гидролизу, что значительно усложняет нроцесс.

Предлагаемый способ позволяет получать протеины в культуральной жидкости. Для этого в качестве микроорганизмов используют один из штаммов Arthrobacter paraflineus № 2411-АТСС 15591, Corynebacterium hydrocarboclastus АТСС 15592, Micrococcus paraffinolyticus № 41-ATCC 15589, Brevibacterium Ketoglutamicum A 2473-ATCC 15588, Arthrobacter roscoparaffinus № 1661-ATCC 15584, характеризующихся следующими свойствами.

Arthrobacter paraffineus

2.Клетки различаются по размерам н форме. Форма разнообразная (искривленные, набухшие, разветвленные). 3. Подвижность: не нодвижны. 4. Окраска ио Граму неоднородная.

Удлиненные клетки проявляют грамотрицательную, в коккоидные - грамположнтельную окраску.

Характеристики культивирования. 1. Колонии на нитательной среде в виде агара: мясной экстракт 3 г, пептон 5 г, агар (отпон1е11ие веса к объему) 1,5%, дистиллированная вода 1000 мл - обильный рост, форма окружности, повсеместно светло-желтый, K0pii4iicвый цвет, непрозрачный, блестящие. 2. КолоНИИ на скошенном агаре. Обильный рост, волокнистые формы, возвьпнающиеся или илоские, непрозрачные, блестящие, светло-желтые до серовато-коричневого, маслянистые.

3.Пнтательный бульон: мясной экстракт 3 г, пептон 5 г, дистиллированная вода 1000 -

слегка мутный незначительный хлопьевидный осадок.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Оитимальная температура 20-30°С, незначительный рост при 37°С. 2. Оптимальное зиаченне рП 6,0-8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробные. 4. Реакция с лакмусом: нет измененнй или щелочная, 5. Желатин:, не ожижается. 6. Сероводород: трат: не восстанавливается до нитрита. 10.Катализ - положительная реакция. 11.Уреаза - иоложительная реакция. 12. Ферментация углеводорода. Штамм культуры растет хорошо, потребляя н-парафии как - единственный источник углерода. Из н-иарафина вырабатывает большое количество глютампновой или уксусной кислоты. 13. Способность к утилизации углеводородов. Из фруктозы и маннита вырабатывает кислоты. Ю При использовании уксусной кислоты или н-парафина на среде Гукера первичный кислый ортофосфат аммония не утилизируется в качестве источника азота. Corynebacterium hydrocarboclastus АТСС 15592 Морфологические характеристики. 1. Палочки размером 0,8X3,0 мк. 2. Коккоидные и 20 разветвлеппые формы наблюдаются редко. Сиоры не образуются. 3. Не подвижны. Пе устойчивы к действию кислоты. 4. Грамположительны. Характеристики культивирования. 1. Колонии на питательной среде из агара имеют округлую форму, гладкие или мелкоморщинистые, возвышающиеся до выпуклости, сплошные светло-розового цвета непрозрач-30 ные маслянистые. 2. Колонии на среде из скошенного агара: умеренный рост, волокнистая форма, блестящие или матовые гладкие или морщинистые светло-розового цвета. 3. КолоНИИ па питательном бульоне: хрупкие в виде35 пленки. Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Воздействие на питательный желатин: ожижение отсутствует. 2. Молоко остается неизменным. 3. B.C. Р. мо-40 локо: щелочная среда, не пентизируется. 4. Картофель: умеренный рост. 5. Нитраты не восстанавливаются до нитритов. 6. Проба на дыхание в присутствии нитрата: отрицательная. 7. Индол не вырабатывается. З.Аце-45 тилметилкарбинол не вырабатывается. 9. Сернистый водород вырабатывается. 10. Крахмал не гидролизуется. 11. В аэробных условиях из глюкозы вырабатывается кислота в соответствии с методом Хьюга и Лейфсона. 12. Из50 ксилозы, сукрозы, лактозы и крахмала не образуются ни кислота, ни газ. 13. Глюкоза, глюконат, цитрат, сукцинат, п-оксибензоат и протокатехуат утилизируются в качестве единственного источника углерода. Салици-55 лат, лг-оксибензоат, гентизат и антранилат не используются в качестве единственного источника углерода. 14. Керосин, и-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан и н-цетан используются в качестве единственного источ-60 пика углерода. 15. Оптимальная температура 25-30°С, скудный рост или отсутствие роста нри 37°С. 16. Реакция с каталазой положительная. 17. Естественная среда и место расаространения: почва.65 1:5 25 Micrococcus paraffinolyticus № 41-ATCC 15589 Морфологические свойства. 1. Форма - сферы или короткие палочки. 2. Размер 0,8-1,2X0,8-1,4 мк. 3. Подвижность - неподвилсны. 4. Окраска грамположительная. Характеристики культивирования. 1. Колонии на питательной среде в виде агара: скудный рост. 2. Колонии па скошенном агаре: скудный рост, волокнистая форма, цвет -от Светло-красного до красновато-оранжевого, маслянистые, блестящие. 3. Питательная среда в виде бульона: слегка мутная, компактный осадок. Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Оптимальная температура 25-37°С. 2. Оптимальное значение рН 6,0-8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробные; случайно-анаэробные. 4. Реакция с лакмусом не изменяется. 5. Ожижения желатины не происходит. 6. Сероводород не вырабатывается. 7. Индол не вырабатывается. 8. Крахмал не разлагается. 9. Нитрат восстанавливается до нитрита. 10. Реакция с ката лазой положительная. 11. Отмечается превосходный рост при использовании н-парафипа в качестве единственного источника углерода. при этом вырабатываются аминокислота и карбонильная кислота, особенно L-глютаминовая и а-кетоглутаровая кислоты. 12. Утилизация сахара: нз фруктозы образуется кислота. 13. Из глюкозы и маниозы образуется незначительное количество кислоты. Из сукрозы кислота не образуется, Brevibacterium Ketoglutamicum № 2473-АТСС 15588 Морфологические свойства. 1. Форма: обычно налочки, редко удлиненные клетки, споры не образуются. 2. Размер 0,7-0,9X0,8-3,0 мк. 3. Подвижность: неподвижны. 4. Окраска по Граму положительная. Характеристики культивирования. 1. Колонии на питательной среде в виде агара: точечные гладкие сплошные непрозрачные и блестящие. 2. Колонии на скошенном агаре: умеренный рост, волокнистые формы, блестящие, цвет розовато-оранжевый, маслянистые. 3. Питательная среда в виде бульона: слегка мутная, нленки на поверхности, плотный осадок. Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Оптимальная температура 25-37°С, при 37°С усиленный рост, 2. Оптимальное значение рП 6,0-8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробные; случайноанаэробные. 4. Реакция с лакмусом не изменяется или изменяется до щелочной. 5. Ожижения желатины не происходит. 6. Сероводород не вырабатывается. 7. Индол не вырабатывается. 8. Крахмал не разлагается. 9. Нитрат восстанавливается до нитрита. 10. Реакция с каталазой иоложительная. 11. Реакция с уреазой положительная. 12. Отмечается превосходный рост при использовании н-парафинов в качестве единственного источника углерода, причем вырабатываются а-кетоглутаровая, L-глютаминовая кислоты и аланин. 13. Утилизация схара: из глюкозы, фруктозы и сукрозы вырабатывается незначительное количество кислоты, мальтоза не утилизируется.

Arthrobacfer roseoparaffinus М 1661-АТСС 15584

Морфологические свойства. I. Форма: обычно короткие палочки. Клетки различаются по размеру и форме, наблюдаются сферические, эллиптические и удлиненные клетки. 2. Размер 0,5-0,7X0.5-3,0 Л1К. 3. Подвижность: подвижные. 4. Окраска по Граму отрицательная.

Свойства культивирования. 1. Колонии на питательной среде в виде агара: умеренный рост, нитевидные структуры, блестящие розовато-оранжевые маслянистые. 2. Питательная среда в виде бульона: слегка замутненная, рост на поверхности отсутствует, незначительный компактный осадок.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Оптимальная температура 25-37°С. 2. Оптимальное значение рН 6,0- 8,0. 3. Потребность в кислороде: аэробные. 4. Реакция с лакмусом не изменяется. 5. Ожижение желатины происходит в виде кратеров. 6. Сероводород не образуется. 7. Индол не об1)азуется. 8. Крахмал не разлагается. 9. Нитрат не восстанавливается до-нитрита. 10. Реакция с каталазой положительная. 11. Реакция с уреазой положительная. 12. Отмечается превосходный рост при использовании н-парафинов в качестве единственного источника углерода, причем вырабатываются аминокислота и карбоновая кислота, особенно соответственно L-глютаминовая и а-кетоглутаровая кислоты. 13. Утилизация сахара: из глюкозы, фрЗКтозы или сукрозы вырабатывается незначительное количество кислоты. 14. Образования аммиака (питательная среда в виде бульона) не происходит.

Из приведенного выше следует, что данный микроорганизм имеет свойства, чрезвычайно сильно отличаюпдиеся от соответствующих свойств известных микроорганизмов, потребляющих углеводороды .в процессе своего роста, особенно в отнощении таких важных характеристик, как цветность окраски, подвижность, окраска по Граму, степень ожижения желатины и использование сахара. К тому же не наблюдается образования кислоты из сорбитола и маннитола, кроме перечисленных выще Сахаров.

Свойства Pseudomonas aeryginosa

Морфология. Палочки размером 0,5- 1,5 мк. 2. Встречаются единичными, спаренными и в виде коротких цепочек. 3. Подвижны. Обладают 1-3 полярными жгутиками. {Монотрихин в соответствии с Рейдом, Нагским, Фарреллом и Хейли.) 4. Грамотрицательные.

Свойства культивирования. 1. Колонии на желатине желтоватые или зеленовато-желтые, окаймленные бахромой, неравномерные, похожие на запутанный клубок, гранулированные, вызывающие быстрое ожижение. Царапины на желатине: быстрое ожижение, жидкость приобретает желтовато-зеленую

или синевато-зеленую окраску. 2. Колонии на агаре крупные распространяющиеся сероватые с темным участком посередине и просвечивающими краями, неравномерные, среда зеленоватая. 3. Колонии на скощенном агаре

обильные тонкие белые блестящие, окраска среды изменяется от зеленой до те.мно-коричневой или черной, флуоресцируют. 4. Колонии на питательном бульоне: заметная мутность, толстые кожистые пленки, обильный

осадок. Среда желтовато-зеленая до синей, причем наблюдается флуоресценция, затем коричневая. Часто образуются пиоцианин, флуоресцеин и пирорубоин.

Физиологические характеристики и биологические свойства. 1. Реакция с лакмусом: образуется мягкий коагулюм с последующей быстрой пептонизацией и восстановлением лакмуса, реакция щелочная. 2. Картофель: пыщный рост, грязновато-коричневый, среда

становится темно-зеленой. 3. Индол обычно не образуется. 4. Нитраты восстанавливаются до нитритов и азота. 5. Глюкоза, фруктоза, галактоза, арабиноза, мальтоза, лактоза, сукроза, декстрин, инулин, глицерин, маннитол и дульцитол не ферментизируются. Глюкоза окисляется до глюконовой кислоты, 2-кетоглюконовой кислоты и других промежуточных продуктов. 6. кровяная сыворотка сжижается, желтая жидкость, зеленоватая на поверхности. Кровь подвергается гемолизу. 7. Культуры имеют заметный запах триметиламина. 8. Аэробны случайно. 9. Оптимальная температура 37°С, хороший рост при 42°С. 10. Патогепны для кроликов, морских свинок,

крыс и мышей. Источник: гнойное отделяемое после ранений.

Способ заключается в следующем. Культивируют один из щтаммов вышеупомянутых микроорганизмов на питательной среде, содержаще йисточники углерода и азота, неорганические соединения и стимуляторы роста. В качестве источника углерода используют углеводороды, например керосин. Могут быть использованы парафины (алканы) с

прямыми и разветвлеттными цепями, содержащие 5-15 атомов углерода, например н-пентан, н-октан, н-декан, /- -додекан, н-гексадекан, изопентан, изооктан и так далее, циклопарафины, например циклогексан и циклооктан, олефины с прямыми и разветвленными цепями, например пентен-2, гексен-1, октен-1, октеп-2 и другие; циклоолефины, например циклогексен и циклооктен; ароматические углеводороды, например бензол, оксиводороды, например легкие, тяжелые, парафиновые масла и т. д. Вместе с углеводородом или углеводородной смесью в ферментациоппую среду могут быть введены небольшие количества таких углеродных источников, как глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза, сахароза, крахмал, гидролизат крахмала и так далее, или другой подходящий источник углерода, например глицерин, маннитол, сорбитол и т. н. В качестве источника азота могут быть использованы различные виды неорганических или органических солей или соединений, например мочевина или аммнак и его соли, такне как сульфат аммония, хлористый аммоний, нитрат аммония и другие, или природные вещества, содержащие азот, например кукурузный напиток, пептон, мясной экстракт. дрожжевой экстракт, казеиновые гидролизаты, рыбная мука и т. д. Могут быть нрименены также смеси из двух и более перечисленны х веществ. К неорганическим соединениям, которые могут быть добавлены в культуральную среду, от юсятся сренокислый магний, дигидрогенфосфат калия, моногидрогенфосфат калия, хлористый натрий, сернистое железо, хлористый марганец, хлористый кальций и другие обычно применяемые соли магния, железа, марганца, цинка, кальция и т. п. Могут быть применены и смеси таких нероганических соединений. Кроме того, в культуральную среду могут быть введены питательные вещества, существенно необходимые для роста данной особи, например такие витамины, как бйотин, тиамин, нантотеновая, п-аминобензойная, никотиновая кислоты и так далее, и различные аминокислоты, например глютаминовая кислота. Ферментацию проводят в аэробных условиях, например в условиях аэробного встряхивания культуры или помешивания погружной культуры с одновременным введением в нее стерилизованного воздуха при 20-60°С. В процессе культивирования поддерживают рН среды 4-10 (предпочтительно 6-9) путем добавления мочевинного раствора аммиачной воды, аммиачного газа, углекислого аммония и т. д. Ферментацию нроводят в течение 1-2 дней. Целесообразно добавлять антибиотики, новерхностно-активные вещества, жирные кислоты в качестве стимуляторов роста. Из аитибиотиков можно использовать пенициллин, бацитрацин, стрептомицин, циклосерин и т. д. Поверхностно-активные вещества включают реагенты не ионного, катионного, анионного или амфотерного типов. Наиболее эффективными являются жирнокислотные эфиры нолиоксиэтиленсорбитана (Ci2-Cig, серия твин) них алкиламиновые соли (Cs-C.g), нолиоксиэтиленалкиламины (Ci2-С, серия Най(Ci2-Cie), алкилтриметиламмониевые галоиды (Ci2-Cis), алкилбензилтриметиламмониевые галоиды (Ci2-Cis), алкилпиридиновые галоиды (Cia-Cis), алкилбетоины (Ci2-Cjs) и другие. Пригодны также различные высшие жирные кислоты, например олеиновая, пальмитиновая, стеариновая и тому нодобные, и их соли и эфиры, например сорбитанмоноолеат, эфир полиоксиэтилепгликольолеиновой кислоты, полиокснэтиленгликольпальмитиповой кнслоты и т. д. эффективно действуют и различные комбинации этих соединений. После завершения ферментации нолученцый протеин отделяют обычным способом, например центрифугировапием, осаждением и т. п. Пример, Arthrobaderparaffineus JN 241I-ATCC 15591 культивируют в злачной соеде, содержащей 1,0% мясного экстракта, 1,0% пептона и 0,5% хлористого натрия, рН (до стерилизации) 7,2, путем аэробного потряхивания в течение 24 час. Культивированную таким образом бактерию прививают в 10%-ной (по объему) пропорции в 3,0 л ферментационной среды, находящейся в 5-литровом вибрационном бродильном чане. Ферментационная среда имеет следующий состав, %: К2НР04 0,2 MgSO4-7H2O 0,1 MnSO4-4H20 0,002 FeSO4-7H2O 0,02 ZnS04-7H2O 0,001 NH4NO3 0,5 Кукурузный напиток 0,1. В начале культивирования в ферментационную среду добавляют 100 мл смеси м-парафинов, содержащих 11-18 атомов углерода. Культивирование проводят при помешивании со скоростью 600 об/мин и аэрации стерильг ым воздухом при 30°С в течение 40 час. Значение рП культуральной среды регулируют в пределах 6,5-7,5 .путем добавления во время культивирования аммиачной воды. По окончании культивирования количество протеина, полученного в водном растворе, составляет 7 г/л. Затем рН-водного раствора, нолученного путем центробежного отделения ферментационной жидкости, доводят до 3--4. Центробежное отделение полученного протеина дает )9 г сырого протеина. Последний снова растворяют в воде (при рН 7-8) н этот протеин осаждают при рН 3,-4. Вновь проводят центробежное отделение, Эти операции повторяют дважды. После сушки при температуре ниже 0°С получают 17 г очищенного протеина, Предмет изооретения Способ получения протеинов путем выращи9Candida lipolytica, Aspergillus oryzae, на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводороды, например керосин, в присутствии водной минеральной среды, стимуляторов роста и кислорода, отли-5 чающийся тем, что, с целью получения протеинов в культуральной жидкости, в качест10ве микроорганизмов используют один из штаммов Arthrobacter paraffineus № 2411-АТСС 15591, Corynebacterium hydrocarboclastus АТСС 15592, Micrococcus рагаffinolyticus № 41-АТСС 15589, Brevibacterium Ketoglutamicum № 2473-АТСС 15588, Arthrobacter roseoparaffinus № 1661-АТСС 15584.