СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ /-ЛИЗИПА Советский патент 1970 года по МПК C12P13/08 

Известен способ получения /-лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной «реде, содержащей в качестве источника углерода углеводородные фракции нефти, в .присутствии необходимых для роста минеральных солей и стимуляторов роста с последующим выделением /-лизина из культур альной я идкости одним из известных способов, -например при помощи ионообменных смол.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход /-лизина.

Для этого в качестве продуцентов используют щтамм Arthrobacter -paraffineus (АТСС 21003), требующий для своего развития гомосерин, а также штаммы Brevibacterium ketoglutamicum (АТСС 21004) и Corynebacterium hydrocarboclastus (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионин и треонин.

Способ получения /-лизина заключается в том, что продуцирующие его микроорганизмы, такие как Arthrobacter paraffineus (АТСС 21003), требующий для своего роста гемосерин, Brevibacterium ketoglutamicum (АТСС 21004) или Corynebacterium hydrocarboclastus (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионин и треопин, выращивают на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода углеводородные фракции нефти, источники азота, неорганические соли и стимуляторы роста. Культивирование производят в аэробных условиях ори температуре от 20 до 40°С и рН среды, равном от 4,0 до 9,0.

В .качестве углеводородных фракций нефти используют к-парафины, содержащие от 10 до 30 атомов углерода в количестве от 1 до

30«/о, можно использовать единичные или смесь нескольких к-ларафинов, таких как н-додексан, н-тридекан, н-тетрадекан, н-пентадекан, н-гептодекан, а смесь последних с другими источниками углерода. В качестве углевода могут быть использованы глюкоза, меласса, в небольшом количестве гидролизат крахмала.

В качестве источника азота используют соли аммония: сульфат аммония, нитрат аммо«ия, хлорнд аммония, карбонат аммония. Неорганические соли используют такие, как фосфат калия, сульфат магния, сульфат лмарганца, хлорид калия, сульфат железа. В качестве стимуляторов роста применяют мясной экстракцией или центрифугированием, йрИ помощи ионнообменных смол.

Пример. Микроорганизм, требующий гомосерин, Brevibacterium ketoglutamicus № 2439 АТСС 15587 выращивали в двухлитровой конической колбе на питательной среде, содержащей 1о/о дрожжевого экстракта, мясного экстракта, 1% пептона и 0,2о/о NaCl в аэробных условиях при температуре 30°С в течение 24 час. Затем выращенную таким образом культуру (маточную) в количестве пересеяли в лятилитровый ферментер, содержащий 3 л питательной среды, -состоящей из Юо/о н-:парафииов, содержащих от 12 до 18 атОМов углерода, 0,1о/о КНаРО ; 0,1о/о К2НР04; 0,1% MgSO4-7H20; 0,0020/0 MgSO4-4H20; 0,020/0 FeSO4-7H2O; 100 у/л хлоргидрата ти.амина; 100 у/мл гомосерина и 2о/о (NH4)2SO4. рН среды равен 6,5.

Культивирование осуществляли при температуре 30°С в аэробных условиях при перемещивании в течение 72 час. При этом в культуральной жидкости образовалось 10 мг/мл /-лизина.

Затем из культуральной жидкости удалили клетки путем ее центрифугирования. Фугат пропустили через ионообменную смолу Амбер.лит IR1-50. рН раствора поддерживали на уровне 7,0 при помощи 0,5 М буферного раствора. Колонку со смолой промывали водой и 0,15 N раствором аммиака. Фракции, дающие положительные реакции на нингидрип, собрали и посредством аэрации удалили из них аммиак. рН раствора, полученного таким образом, довели до 2,0 6 N соляной кислотой (ПС1), далее при пониженном давлении раствор сконцентрировали. В полученное вещество добавили немного воды и спирта и получили 20 г сырых кристаллов гидрохлорида /-лизин.

Характеристика щтаммов, продуцирующих ./-лизин.

1. Arthrobacter paraffineus.

Выделен из почвы.

Морфология. Короткие палочки, разветвленные, изогнутые или булавовидной формы; встречаются шаровидные клетки, неподвижны, опор не образуют, грамположительные и грамотрицательные. Размером 0,5-0,8X1 - 3 мк (щаровидные клетки 0,6-0,8 мк). В кислотах не окращиваются.

Культуральные свойства.

Минеральная среда. Агар: рост значитель;ный; колонии круглые гладкие, сплощные, бледного желтовато-коричневого цвета, непрозрачные, блестящие. На косом агаре: рост значительный; колонии нитевидные, бугристые или плоские, блестящие, бледного желтоватосеровато-коричневого цвета, маслянистые. Бульон слегка мутный, с небольщим хлопьевидным осадком. Оптимальная температура развития - 20-30°С, рН среды 6,0-8,0, аэробные, факультативно анаэробные. Лакмусовое молоко остается без изменения или щелочная реакция; желатину не разжии :ает,

индол не выделяет, крахмал не гидролизует, нитратов не образует. Хорощо растет на средах, содержащих в качестве углерода н-парафины и вырабатывает -большое количество L-глютаминовой кислоты из н-парафинов или уксусной кислоты. Вырабатывает кислоту из фруктозы и маннита;

2.Micrococcus paraffinolyticus.

Морфология. Шаровидной формы или в виде палочек. Размером 0,,2X0,8-1,4 мк. Неподвижны, однако среди микроорганизмов, принадлел :ащих к этому виду, имеются некоторые культуры, обладающие небольщой

способностью передвигаться. Грамположительные.

Минеральная среда. Рост ограничен плоскими культурами на агаровом бульоне. На косом агаре рост незначителен. Культуры нитевидной формы блестящие, ярко-красного или красновато-оранжевого цвета, маслянистые. На бульоне образуется -небольшая мутность и осадок. На поверхности роста нет. ОПтимальная температура развития 25-37°С. рН среды 6,0-8,0. Аэробные, возможно анаэробные. Лакмусовое молоко не изменяет, желатину не разжижает, сероводород не выделяет, индол не выделяет, крахмал не разлагает. Соль азотной кислоты восстанавливает (существуют некоторые виды, которые не вызывают восстановления соли азотной кислоты). При применении н-пара финов в качестве источника углерода рост отличный, при этом вырабатываются аминокислота и карбоновая кислота,

в особенности L-глютаминовая кислота и альфа-кетоглутаровая кислота.

Отнощение к сахарам. Хорошо использует фруктозу, хуже глюкозу и манозу.

3.Brevibacterium ketoglutamicum.

Морфология. Короткие палочки, ио иногда встречаются относительно длинные клетки. Размеры их 0,7-0,9X0,8-3,0 мк, неподвижны грамположительные. Минеральная среда. На агаре в чашках

Петри рост умеренный. Культуры в виде зерен, плоские и гладкие, плотные, непрозрачные, блестящие. На косом агаре рост умеренный. Культуры нитевидные, блестящие, бледно-красновато-оранжевого цвета; маслянистые. На бульоне образуется небольшая мутность и осадок, на поверхности образует плеНку. Оптимальная температура развития 25- 37°С, при температуре 37°С рост значителен. Оптимальная величина рН среды 6,0-8,0.

Аэробные, могут быть анаэробные. Лакмусовое молоко ле изменяет или изменяет в щелочное, л елатину не разжижает, сероводород не выделяет, индол не образует, крахмал Не разлагает, соль азотной -кислоты восстанавливает. При использовании н-еарафинов в качестве источника углерода рост отличный с выделением альфа-кетоглутаровой и L-глютаМИновой кислот и аланина. Отношение к сахарам. Использует глюкозу, фруктозу и сахарозу

4. Corynebacterium hydrocarboclastus.

Морфология. Палочки размером 0,8X3,0 ж/с. Шаровидная форма и разветвления встречаются редко. Споры не образует. Неподвижны. Некислотоустойчивы. Грамположительны.

Минеральная среда. Колонии «а агаре круглые, гладкие или с мелкими морщинами, выпуклые, сплошные, бледно-розового цвета, непрозрачные, маслянистые. На косом агаре: рост умеренный, нитевидной формы, блестящие или тусклые, гладкие или морщинистые, бледно-розового цвета. На .бульоне хрупкая пленка, желатину не разжижает, молоко не изменяется, молоко В. С. Р. щелочное, не пентонизирует. Картофель: умеренный рост. Нитраты не восстанавливает в нитриты, индол не выделяется, ацетилметилкарбонол не выделяет, сероводород выделяет (некоторые культурь не выделяют H2S). Крахмал ве гидролизует, некоторые культуры крахмал гидролизуют. Из глюкозы образует кислоту, но газа не образует. Аэробная кислота получается из глюкозы способом Хюга и Лейфсона (Hugh and Leifson). Из ксилозы, сахарозы, лактозы и крахмала не образуется ни кислот, ни газа. Глюкоза, глюконат, цитрат, соль янтарной кислоты, роксибензоат и протокатехоат используются как единственный источник углерода. Использование бензоата зависит от вида культуры. Соль салициловой кислоты, т-оксибензоат, гентисат и антралинат не используются в качестве единственного источника углерода. Керосин, н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетрадека;н и я-цетан используются в качестве единственного источника углерода. Оптимальная температура развития 25-30°С.. Предмет изобретения

Способ получения /-лизина путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей в качестве

источника углерода углеводородные фракции нефти IB присутствии необходимых для роста минеральных солей и стимуляторов роста с последующим выделением /-лизина из культуральной жидкости одним из известных способов, например при номощн ионообменных смол, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода /-лизина, в качестве продуцентов используют штамм Arthrobacter paraffineus (АТСС 21003), требующий для своего развития гомосерин, а также штаммы Brevibacterium ketoglutamicum (АТСС 21004) и Согупеbacterium hydrocarboclastus (АТСС 2/131), требующие для своего развития метионин и треонин.