Способ определения качества половых продуктов у самцов карповых рыб Советский патент 1985 года по МПК A01K61/00 

Н) W8

нгк

т

из

СЕЙ8ИЯ

нгв нгл

HJ Изобретение относится к области биотехники разведения рыб, в частности к способам определения качества половых продуктов у самцов карповых рыб, и может быть использовано в процессах селекции и промьшшенного разведения рыб. Целью изобретения является повы шение точности диагностики степени зрелости н качества сперматозоидов На чертеже изобра ено накопление субфракции гистона НТ.(Н1,) в сперма тогенезе белого дмура: а - гистоны тимуса теленка (контроль) , б - незр лые семенники, в - зрелые семенники белого амура, г - смерматозоиды, д - печень белого амура (контроль) Способ позволяет получить объективные показатели спермы рыб и своевременно обеспечить хозяйства рыбопосадочным материалом, что при разведении растительноядных рыб повысит качество продукции .на 10-1 Важным преимуществом способа является также то, что анализ осно ван на определении генетически обу словленного и легко измеряемого признака (накопление конкретного белка), что позволяет проводить, сравнение различных производителей в разные периоды их жизни, т.е. рыб, отличающихся по возрасту, что весьма важно для рыбоводной практи ки и селекционной работы с рыбами. Способ осуществляется следующим образом. Сперматозоиды карповых рыб фикси руют в этиловом спирте. Перед выделением ткань взвепшвают. Пробу гомогенизируют в буферном растворе содержащем 0,25 М сахарозы, 10 мМ трис-НСЕ, рН 7,5, 10 мМ MgClg, 25 мМ KCf и 25 мМ . Гомогенат центрифугируют при 3000 g 15 мин, осадок обрабатывают 0,5%-ны тритоном Х-100 в буферном растворе и затем отмьшают от тритона Х-100 трехкратной промьшкой ядер в буферном растворе. Затем ядра заливают 0,4 н. HCF и экстрагируют гистоны в течение 4 ч при 4°С. После центрифугирования при 3000 g супернатант заливают трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 18%. Гистоны осаждают в течение 24 ч при 4°С, затем осадок собирают центрифугированием, промьшают один раз подкисленным (0,25 н. HCf) 69 ацетоном и трижды - чистым ацетоном, после чего гистоны высушивают под вакуумом. Электрофорез проводят в 15%-ном полйакриламидном геле, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия. Гели окращивают красителем - 0,1%-ным кумасси голубым R-250. Полосы, соответствующие субфракциям гистона HI, и Н1 , вырезают и помещают в 1%-ный дбдецилсульфат натрия. Инкубацию полос проводят в течение 24 ч при 37°С. Затем измеряют поглощение проб с элюировавщей краской приЯ 590 на спектрофотометре. Краситель пропорционально связьшается с гистонами, поэтому по соотношению концентрации краски, элюировавшей из полос, содержапщх субфракции HI, и НГ , можно судить о соотношении концентрации белков в этих субфракциях. К зрелым сперматозоидам откосят те, у которых соотношение составляет 3:1. . . Использование для осуществления способа 0,4 м. НСЕ обеспечивает более полную экстракцию гистонов из ядер и является оптимальной концентрацией кислоты. Для получения чистых ядер проводят трехкратную отмьшку в буферном растворе, поскольку при двухкратной отмывке в них еще присутству- ют загрязняющие факторы, например липиды. ., Четырехкратная промывка только усложняет способ и не дает улучшения качества ядер. Для упрощения способа и возможности применения его в промышленных масштабах в качестве растворителя использован нетоксический детергент - додецилсульфат натрия. Измерение количества краски по поглощению при длине волны 590 ммк обусловлено тем, что при этой длине волны находится максимум поглощения использованного красителя кумасси голубого R-250. Количество же и набор реагентов выбраны исходя из требований нормального протекания всех процессов, а также потому, что при отмьгоке ядер необходимо использовать десятикратный объем буфера по отношению к объему ядер.

СПОСОБ. ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛОВЫХ ПРОДУКТОВ У САМЦОВ КАРПОЫ)1Х .РЫБ, предусматривающий отбор пробы спермы и последующее ее изучение на функциональную активность, о т W, личающийся тем, что, с целью повышения .точности диагностики степени зрелости и качества сперматозоидов, отобранную пробу подвергают гомогенизации в сахарозном буфере с последующим центрифугированием, обработкой осадка в буфере в присутствии тритона Х-100, трехкратной отмывкой от тритона Х-100 . чистым буфером и экстрагированием .гистонов из осадка ядер в 0,4 н. HCf, после чего гистоны высушивают, подвергают электрофоретическому анализу в полиакриламидном геле, гели окрашивают и проводят элюирование краски из полос субфракций HI, и Ш в 1%-ном додецилсульфате натрия, количество которой измеряют по поглощению при Л 590 на спектрофотомере, а функциональную активность спермы определяют по соотношению -фракций.HI, / HL , при этом к зрелым относят сперматозоиды, у которых соотношение HI,/HJg составляет 3:1. нг, HI,