Штамм @ @ ,используемый для получения вибриоцина холерного вибриона Советский патент 1987 года по МПК C12N15/00 A61K39/108 C12N15/00 C12R1/19 

112

Изобретение относится к микробиологии, в частности к производству антибактериальные и противоопухолевых препаратов.

Целью изобретения является создание штамма, способного продуцировать бактериоцин - вибриоцин холерного вибриона и безопасного для окружающих.

15

20

25

30

При проведении исследований, связанных с изучением генетического де- терминирования фактора вибриоциноген- ности у холерного вибриона, мобилизацией на перенос с помощью плазмиды RPA удалось передать кишечной палочке от Эльтор вибриона плазмиду вибриоциногенности pVib.. При этом оказалось, что плазмиды RP4 и pVib образуют сравнительно стабильный ко- интеграт RP4::Vib с суммарной молекулярной массой 42,0 мегадапьтона.

Клетки кишечной палочки с RP4 и pVib благодаря особенностям своего нового хозяина продуцируют вибриоцины в 10 раз больше, чем родительский штамм холерно го вибриона V.eltor 637/67. Сконструированный штамм Escherichia coli QD 5003 К-50 депонирован в коллекции государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им.Л.А.Тарасевича МЗ СССР под номером 127.

Штамм E.coli 127 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма 127 кишечной палочки в мазках из суточных культур имеют вид коротких палочек ,0x0,3- -0,4 мк. Неподвижны . Грамотрицатель- ны. Полиморфизм выражен умеренно.

Агар ЬВ-образует мутные колонии серовато-белого цвета.

Агар Хоттингера (рН 7,6) образует мутные колонии серовато-белого цвета

Бульон Хоттингера вызывает помутнение среды.

Физиолого-биохимические признаки. . Сбраживают с образованием кислоты газа лактозу, глюкозу, арабинозу,, аннозу, галактозу. Не ферментируют ахарозу. Образуют коагулазу и фибри- олизин. Оптимум температуры культиирования 37 С.

Устойчив к канамицину и ампицили- у (100 мкг/мл), а также к тетращ-ж- шну (20 мкг/мл). Зависит от проли40

45

55

на. Лизируется кишечными фагами Т-7 и//-У1г.

Клетки штамма авирулентны для белых мьшей и морских свинок при под15

0

5

0

0

5

тивальном заражении в дозе до 10 м.к.

Штамм несет искусственно полученный коинтеграт плазмид RP4 и pVib, который позволяет ему в контролируемых условиях образовывать большие количества вибриоцина, в 10-15 раз превьппающие уровень продукции бакте- риоцина родительским штаммом V.eltor 637/67.

Использование штамма 127 иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Клетки штамма E.coli 127 вьфащивают в бульоне Мартена (рН 7,2) при 37 С со встряхиванием до оптической плотности 0,6 и

добавляют О,,5 мкг/мл митомицина С. Через 6-12 ч клетки собирают центрифугированием и трехкратно обрабатывают 1 М раствором NaCl. Полученные солевые экстракты объединяют и после соответствующего разведения исслел}уют на вибриоцин биологическим методом отсроченного антагонизма по Фредерику с использованием в качестве индикаторного штамм E.coli и V.chole- гае Nag 296/1.

Четкое пятно подавления роста индикаторной культуры регистрируется при использовании экстрактов, разведенных в 10 раз.

Пример 2. Клетки предлагаемого штамма кишечной палочки 127 высевают в виде макроколоний на 1,5% агар LB и проверяют на спо обность продуцировать, вибриоцин биологическим методом (Frederica, 1952) с помощью индикаторных штаммов E.coli V.chole- гаё Nag 296/1. Об активности бакте- риоцина судят по величине зон подавления роста индикатора.

П р и м е р 3. 18-24-часовую бульонную культуру штамма E.coli 127, об- работанную митомицином С с целью индукции вибриоцина, центрифугировали для освобождения от клеток, а прозрачную надосадочную жидкость использовали в качестве источника вибриоцина. Активность вибриоцина оценивали по изменению оптической плотности взвеси микробных клеток индикаторных штаммов при взаимодействии с центрифуга

312932164

том. Величина активности, выраженная li 127 на 12-14 уСл.ед. превьппапа ак- в условных единицах (Бадалова И.М. с тивность вибриоцина родительского соавт., 1984), у данного штамма Е.со- штамма V.eltor 637/67.

Штамм Escherichia coli, 127 (Коллекция Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича), используемый для получения вибриоцина холерного вибриона. (/ С