Способ диагностики воспалительных заболеваний дыхательного тракта в фазе ремиссии Советский патент 1986 года по МПК A61K39/00 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано для диагностики воспалительных заболеваний дыхательного тракта.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет нагревания клеток крови до .

Способ осуществляют следующим образом.

К геперинизированной периферической крови (содержащей 20-60 ед гепарина в 1 мл) добавляют 3%-ный раствор желатины в физрастворе в количестве 1 мл на 3 мл крови. Кровь выдерживают при 37 - 38°С в течение 40 мин. Верхний лейкоцитарный слой собирают. Клетки дважды отмывают средой 199, осаждают каждый раз центри фугированием при 200 g в течение 10 мин. В промежутке между отмывками оставшиеся эритроциты лизируют путем добавления 1 мл дистил.лированной воды на 15 с. Готовят супензию, содержащую 1-б-Ю клеток в 1 мл. С полученной суспензией клеток ставят реакцию s-розеткообразования (е-РО) в двух вариантах.

Спонтанное s-PO. К 0,1 мл суспензии клеток приливают 0,1 мл 0,6%-ной суспензии эритроцитов барана. Смесь центрифугируют при 200 g в течение 5 мин и инкубируют при 4°С в течение 30 мин. Осадок осторожно ресуспендируют, фиксируют путем выдерживания с 0,05 мл 3%-ного раствора глутарового альдегида в течение 5 мин и отмывают дистиллированной водой, осаждая центрифугированием при 200 g в течение 5 мин. Из осадка делают мазок, который сущат на воздухе. Мазок фиксируют путем выдерживания в метаноле в течение 10 мин и окрашивают метилова1м зеленььм - пиро- нином. npoc4HTbn3a4j-r 1;оличество е-розетко- образующих лимфо11итов на 100 лимфоцитов и е-розеткообразующих нейтрофилов на 100 нейтрофилов.

е-РО после предварительной нагрузки на клетки. В пробирку вносят 0,1 мл суспензии клеток, содержащей 1-5-10® клеток в 1 мл. Выдерживают при 36-37°С в течение 0,5-1,5 ч. После этого приливают 0,1 мл 0,6%-ной суспензии эритроцитов барана. Ставят реакцию е-РО и оценивают результаты так же, как и в случае спонтанного

8-РО.

Для лимфоцитов и для нейтрофилов определяют разность между уровнями спонтанного t-PO клеток и .-РО клеток после предварительной инкубации при 37°С, т. е. уровней 8-РО лимфоцитов, полученных по первому и второму вариантам и уровней е-РО нейтрофилов, полученных по первому и второму вариантам. Если количество е-РО лимфоцитов уменьшается на 5-30% и при этом количество к-РО нейтрофилов увеличивается на 5-30%, то диагностируют ремиссию хронического бронхита.

5

0

5

0

5

0

5

5

0

Нижний предел колебаний розеткообра- зующих Т-лимфоцитоБ и нейтрофилов (5%) дан с тем расчетом, что нижняя цифра должна превышать ошибку одпо1 о измерения, составляющую не более 5%- а верхний - исходя из изменений данного параметра у больных хроническим бронхитом.

Пример 1. Рабочая Н. Е., 42 года, обследована амбулаторно в период диспансеризации. Для иммунологического обс-ледованяя у больной взяли 4 мл крови из локтевой вены в пробирку, содержащую 0,5 мл раствора гепарина (в концентрации 200 ед/мл). Кровь перемешивали с 1,3 мл 3%-ного раствора желатины и выдерживали для расслаивания при 37°С в течение 40 мин. РЗерхний лейкоцитарный слой отбирали. В пробирку, содержащую лейкоцитарный слой, приливали среду 199 до объема 10 мл, перемешивали. Клетки осаждали центрифугированием при 400°С в течение 10 мин. Надосадочную жид- кость сливали, осадок ресусиендировали. Для лизиса оставшихся эритроцитов к осадку добавляли 1 мл дистиллированной во,ы. выдерживали 15 с, затем доливали среду 199 до объе.ма 10 мл. К-тетки осаждали центрифугированием. Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуснендировали. К осадку прилиЕ,али среду 199 в гаком количестве, чтобы концентрация клеток в суспензии составила 1-5-10 в 1 мл.

С полученной суспензией ставили реакцию 8-РО в двух вариантах.

К 0,1 мл полученной суспензии клеток приливали 0,1 мл 0,6%-ной суспензии эритроцитов барана, центрифугировали пои 200°С 5 мин, инкубировали при 4°С 30 мин, осадок ресуспендировали. добавляли 0,05 мл глутарового альдегида {3%-Hoi-o раствора), с которым выдерживали в течение 5 .мин, прили ают дистиллирозанную до объема 10 мл, центрифугировали при 2GOg 5 мин, делали мазок. Мазок фиксировали в метаноле, окрашивали метиловым зеленым - пи- ронином и затем просчитывали количество розеткообразующих клеток.

По второму варианту 0,1 M,:I нолучешюй суспензии клеток инкубировали при 37 С в течение 0,5 ч. После этого к суспензии приливали 0,1 мл 0,6%-ной супензии эритроцитов барана и ставили реакцию к-РО аналогично первому варианту.

Дапные подсчета уровней розеткообразующих клеток позволили выяв1- ТЬ с.педую- Hiee. Уровень спонтанных е-РО лимфоцитов составил 81%, к-РО нейтроцЬилов - 9%. Эти показатели находятся в пределах нормы, поэтому на основании них (т. е. на основании определения только уровня спонтанных в-розеток) к какому-либо определенному выводу прийти трудно. У этой же больной после предварительной iiai-рузки НЕ клетки в виде инкубации ири в течение 0,5 ч уровень е-РО лимфоцитов составил 52%, 8-РО нейтрофилов - 32%. Следовательно,

в результате нагрузки на клетки количество 8-РО лимфоцитов у данной больной снизилось на 29%, а количество 8-РО нейтрофилов повысилось на 13%, что соответствует диагнозу воспалительных заболеваний дыхательного тракта в фазе ремиссии. Клиническое обследование подтвердило диагноз - хронический бронхит в фазе ремиссии. Больной было рекомендовано, а затем осуществлено профилактическое лечение с применение.м ингаляций раствором левамизола.

Повторное обследование той же больной было осуществлено спустя 6 мес после курса профилактического лечения. В результате этого обследования было выявлено, что уровень спонтанных 8-РО лимфоцитов составил 65%, 8-РО нейтрофилов - 25%, т. е. также в пределах нормы. В результате нагрузки в виде инкубации клеток в течение 0,5 ч при 37°С уровень в-РО лимфоцитов составил 68%, уровень в-РО нейтрофилов -- 30%, т. е. по сравнению со спонтанным количество 8-РО лимфоцитов увеличилось на 3%, количество 8-РО нейтрофилов увеличилось на 5%, что соответствует состоянию нормы. В течение 6 месяцев после курса профилактического лечения у больной не наблюдалось ни одного обострения хронического бронхита, клиническое обследование также подтвердило существенное улучщение состояния больной.

Пример 2. Больной В. С., 45 лет, обследован амбулаторно в период диспансеризация. Иммупологическое обследование больного осуществляли аналогично примеру 1. Исключение составило лишь время инкубации клеток при 37°С перед постановкой реакции РО (второй вариант постановки реакции е-РО): клетки инкубировали при в течение 1,5 ч.

Данные иммунологического обследования следующие: уровень спонтанных е-РО лимфоцитов составил 72%, к-РО нейтрофилов - 33%, что находится в пределах нормы. После предварительной нагрузки в виде инкубации клеток при 37°С в течение 1,5 ч уровни 8-РО лимфоцитов составили 59%, е-РО нейтрофилов -- 49%, т. е. уровни е--РО лимфоцитов понизились на 13%, уровни 8-РО нейтрофилов повысились на 16% (в результате инкубации клеток в течение 0,5 ч у того же больного уровни 8-РО лимфоцитов по сравнению со спонтанными снизились на 15%, уровни в-РО нейтрофилов повысились на 18%). Это соответствовало диагнозу, поставленному больному в результате подробного клинического обследования; хронический бронхит в фазе ремиссии. Больному было рекомендовано, а затем осуществлено профилактическое лечение путем ингаляций масляным раствором стафилококковой вакцины.

Повторное иммунологическое обследование больного эти м же способом спустя 6 мес. показало, что уровень спонтанных f-PO лимфоцитов составил 75%, 8-РО нейтроф(-;лов

28

В результате нагрузки

в виде инкубации клеток в течение 1,5 ч нри 37°С уровень 8-РО лимфоцитов (8-РОЛ) составил 60%, 8-РО нейтрофилов (8-РОН) - 35%, т. е. уровни 8-РОЛ повысились на 15%, уровни 8-РОН повысились на 7%, что соответствует статусу хронического бронхита в ремиссии. Подробное клиническое обследование подтвердило поставленный диагноз. За период, прошедший с момента первого обследования, у больного дважды отмечалось обострение хронического бронхита.

Предлагаемый способ позволяет выявить достоверные различия разностей уровней (г -РО лимфоцитов и 8-РО нейтрофилов после инкубации клеток при (в течение 0,5 и.ли 1,5 ч) и спонтанных 8-РО, причем эти различия яв:1яются не только достоверными, но и суи1ественными. Вместе с тем раз.1;1чия в ве.чичине разности (спонтанные f-P() клетки - 8-РО клетки) после применения магрузки у здоровых и больных хроническим бронхитом в фазе ремиссии наиболее четко проявились в результате инкубации клеток при 36-37 С. При более низкой температуре инкубации (35°С) различия в уровнях данных параметров проявились более слабо. В резу.чьтате инкубации при 38°С ухуд1налось качество препаратов, поскольку клетки деформировались, что затрудняло оценкч результатов. Следовательно, оптимальной температурой д,1Я инкубации клеток является 36-37°С. Применение этой температуры позволяет выявить максимальные раз, ;1гчия в уровнях пара.метров в группах при хорО1ием качестве препаратов.

Таким образом предлагаемый способ позволяет повысить точность диагностики в 100% случаев, поскольку согласно известному способу осуществлять диагностику было невоз.можно.