Способ определения иммунологического состояния организма Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

Е

о :о Изобретение относится х медицине и может быть использовано как для анализа Т-В и А-клеточных систем у здоровых людей, так и для диагностики заболеваний (первичных и вторичных иммунодефицитов). Известен способ определения Т- и В-популяций лимфоцитов периферической крови человека путем розеткообразования (РО) с эритроцитами барана или мыши соответственно, включающий вьаделение моноядерных клеток градиентным центрифугированием крови на гипак-фикелле при 400 g в течение 50-40 мии, отмывку клеток, смешение полученной суспензии клеток с суспен зией эритроцитов из расчета 50 100 эритроцитов на одну клетку с добавлением 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки, инкубацию смеси в течение 5 мин при 37°С, центрифугирование при 100-150 g в течение 5 мин и инкубацию при 4 С в течение 18 ч с эритроцитами барана или при в течение I ч для РО с эритроци тами мьнпи споследующим подсчетом количества розеткообразующих лимфоцитов в-гемоцитометрах LU Однако данный способ требует боль ших затрат времени, что делает невозможным егЪ применение в клинике, не является универсальным, так как не позволяет определять РО другими клетками, кроме того, является малочзгествительным к изменению функциоиалышго состояния клеток при патоло гиях. Известен также способ определения Т-клеток, который включает вьаделение лейкоцитов из крови после.добавления желатины путем расслаивания в ,тече 40-50 мин (седиментация эритроцитов при I g), трехкратную отмывку клеток с добавлением перед второй отмывкой дистиллированной вода на 15 с, приго Iовление клеточной суспензии, содержащей клеток в 1 мл, смешение суспензии с равным объемом 0,4%-ной взвеси эритроцитов барана, инкубащсю ;при в течение , центрифугироваш1е при 200 g 5 мин, инкубацию при 12 С в течение 1 ч , вьщержива1ше с глутаровым альдегидом в течение 20 мин, отмывку от глутаро вого альдегида, приготовление и окраску мазков и подсчет количества розеткорбразукицих клеток 2 , Однако данный способ также требуе значительных затрат времени и включа ет большое число манипуляций, что затрудняет его широкое использование в клинике, кроме того, является недостаточно чувствительным к изменению функционального состояния клеток. Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения иммунологического состояния организма, включанхцему вьщеление лейко1щтов крови седиментацией в желатине, добавление эритроцитов, инкубирование, фиксацию и подсчет розеткообразую1цих клеток, вьщеление лейкоцитов осуществляют путем центрифугирования при 45.g в течение 15-25 мин, а инкубацию с эритроцита ш проводят при 4-12 С в течение 28-32 мин. Способ ос пцествляют следующим образом. К гепаринизированной периферической крови (20-60 ед. гепарина на I мл крови) добавляют 3%-ный раствор желатины на физрастворе в количестве } мл. на 3 МП крови и центрифугируют при 4-5 g 15-25 . Верхний, лейкоцитарный слой собирают в центрифужную пробирку и измеряют его объем. Добавляют среду Хенкса до общего объема 1011 мл, центрифугируют при 400 g 10 мин, а надостаточную жидкость слиBasjT. Осадок ресуспендируют, добавляют к нему 1 мл дистиллированной воды, взбалтывают, а через 15 с приливают среду Хенкса до объема 10-11 мл. Центрифугируют при 200 g 10 мин, насадочную жидкость сливают. Осадок ресуспе ируют, добавляют к нему среду 199 из расчета 0,8 мл на 1 мл лейкрцитарного слоя. О,1 мл полученной суспензии смешивают с 0,6%-ной взвесью эритроцитов (для определения эритрохфтами мшш в смесь добавляют 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки) , смесь центрифугируют при 200 g 5 мин и инкубируют при 4-12с 28-30 мин. Затем осадок ресуспендируют, добавляют к нему 0,05 мл 3%-ног.о раствора глутарового альдегида в фосфатном буфере, выдерживают 5-6 мин и приливают 10 мл дистиллированной воды. Центриугируют, надосадочную жидкость сливат, а из осадка готовят мазки. Мазки сушат на воздухе, окрашивают и подсчитывают количество РОК для всех ВН ов клеток крови. Пример 1. Берут 6 мл крови в пробирку, содержащую 0,6 мл раствора гепарина на физрастворе (200 ед. в мл), добавляют 2 мп 3%-ного раствора желатины, перемешивают и центрифугиру ют при 5 g 25 мин. Верхний слой.собирают в центрифужную пробирку, (получено 2,3 мл верхнего лейкоцитарного слоя). Приливают среду Хенкса до объ.ама II мл, центрифугируют при 400 g 10 миц.Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендирутот. Приливают 1 мл дистиллированной воды, В14держива ют 15с. Затем добавляют среду Хенкса до 11 мл и центрифугируют 10 мин при 200 g. Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему 2,5.мл 199 среды. 0,1 мл полученной взвеси клеток смешивают с 0,1 мл 0,6%-ной суспензии эритроцитов барана. В другой пробирке смешивают 0,1 мл полученной взвеси клеток с 0,6%-ной суспензией эритроцитов мыши (0,1 мл) и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки инактивирован ной адсорбированной).Центрифугируют при 200 g 5 мин. Инкубируют при 4 С 28 мин. Осадки ресуспендируют, добавляют к ним 0,05 мл 3%-ного раствора глутарового альдегида, вьщерживают 5 мин. Затем в пробирки наливают по 6-10 мл дистиллированной воды, центрифугируют при 200 g 5 мин, надо садочную жидкость сливают. Готовят мазки, сушат на воздухе. Препараты фиксируют в метаноле, окрашивают метиловым зеленым - пиронином, подсчитывают Количество лимфо1Д1тарных розе ток на 100 лимфоцитов и нейтрофиль- ных розеток на 100 нейтрофилов. П р и м е р 2. Берут 3 мл крови в центрифужную пробирку, содержащую 0,6 мл гепарина (20% ед. в мл) и 1 мл 3%-ного раствора желатины, пере мешивают. Центрифугируют при 4 g 15 мин. Верхний «лой в количестве 1,5 мл собирают в центрифужную пробирку. Приливают сгбду Хенкса до объ ема 11 мл, центрифугируют П1ж 400g 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Приливают 1 м дистиллированной воды, выдерживают 15с. Затем добавляют среду Хенкса д 11 мл, центрифугируют при 200g 10 ми Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нет му 1,2 мл 109 среды, О,1 мл полученной взвеси клеток смешивают с О,1 мл 0,6%-ной суспензии эритроцитов барана, а в другой пробирке - с О,1 мл 0,6%-ной суспензии эритроцитов и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Центрифугируют при 2.00g 5 мин. Инкубируют при 7 С 30 мин. Далее - так же, как в примере 1. П р и. м е р S. Берут 3 мл крови в центрифужную пробирку, содержащую 0,3 мл гепарина (200 ед. в мл), добавляют 1 мл 3%-ного раствора желатины, перемешивают. Центрифугируют при 4-5g 20 мин. Верхний слой в количестве 1,5 мл собирают в центрифужную пробирку. Приливают среду Хенкса до объема П иц, центрифугируют при 400g 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Приливают 1 мл дистиллированной воды, В14держнва1бт 15 с. Затем добавляют среду Хенкса до 1I мл и центрифугируют при 200g 0 мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют и добавляют к нему I,2 мл среды 199. 0,1 мл полученной взвеси клеток смешивают с О,1 мл 0,6%-ной суспензии эритроцитов барана, а в другой пробирке - с 0,1 мл 0,6%-ной суспензии эритро1щтов мыши и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Центрифугируют при 200g 5 мин. Инкубируют при 12 С.30 мин. Далее - так же, как в примере 1. П р и м е ,р 4 (контрольный. Ьерут 6 мл крови в пробирку, содержащую 0,6 мл раствора гепарина (200 ед. в мл), добавляют 2 мл 3%-ного раствора желатины, перемешивают н вьщерживают при 37 С 40 мин. Верхний слой собирают в центрифужную пробирку. Приливают среду Хенкса до объема 11 мл, центрифугируют при 400g 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют. Приливают 1 мл дистиллированной воды,выдерживают 15 с. Затем добавляют среду .Хенкса до 11 мл и центрифугируют при 200g 10 мин. Надосадочную жидкость сливают. Осадок ресуспендируют, добавляя к нему 11 мл среды Хенкса и центрифугируют jipH 200g 10 мин. Надосадочную Я5йдкость сливают. Готовят суспензию клеток, содержащую 2-10 клеток в 1 мл среды 199. 0,1 мл полученной взвеси клеток- смешивают с 0,5 мл О,4%-ной суспензии эритроцитов барана. В другой пробирке О,1 мл взвеси клеток смешивают с О,1 мл 0,5%-ной суспензии эритроцитов мыши и 0,05 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Смесь инкубируют при 37°С 5 мин, а затем центрифугируют при 200g 5 мин. Инкубируютпри 12°С 60 мин. Осадки ресуспендируют, добавляя к ним 0,05 мл 3%-ного раствора глутарового альдегида, вьщерживают 20 мин. Затем в пробирки наливают 8-10 мл дистиллированной воды, центри фугируют при 200g 5 мин, надосадочну жидкость сливают. Готовят мазки, сушат на воздухе, Препараты фиксируют в метаноле, окрашивают метиловьпм зеленым - пиронином, считают количество розеток на 100 клеток. РО клетками периферической крови представлено в таблице. Данные, приведенные в таблице, показывают, что предлагаемый способ по сравнению с прототипом более чувствителен к изменениям функционального состояния клеток у здоровых и больных. Это подтверяд ается тем, что при исследовании групп боль ных предлагаемым способом возрастает достоверность различия показателей, полученных для групп больных в сравнении со здоровыми донорами. Так, при исследовании групп больных острой пневмонией и раком гортани в сравнении с группой здорОвых доноров предлагаемым способом достоверность различия почти всех показателей более 95% (для Е-Ро нейтрофилов у боль ных раком гортани достоверность различия при сравнении с группой здоровых более 99%). При исследовании этих же групп по прототипу р4зличия между группами в большинстве случаев были недостоверны, т,е, достоверность различия бьша менее 95%. Таким образом, повышение чувствительности подразумевает возможность четкого определения изменений функциональной активности клеток у больных в сравнении со здоровыми, а значит, более надежного определения иммунодефицитов или состояния повышенной функциональной активности. Такое повышение чувствительности способа достигается за счет более быстрого выделения клеток, на которое уходит 4050 мин вместо 80-90 мин по прототипу, что уменьшает вероятность травмирования клеток и способствует сохранению такого функционального состояния клеток, какое было в крови; уменьшение времени инкубации после центрифугирования с 60 (прототип) до 28-32 мин учитывает динамику РО : если клетки имеют нормальную функциональную активность (у здоровых),то РО завершается на 20-25 мин инкубации, далее количество розеток не изменяется. Если клетки имеют низкую функциональную активность, то РО проходит медленнее, за 60-90 мин, и инкубация в течение 28-32 мин позволяет более четко установить уменьшение функциональной активности.

Здоровые доноры (25 чел.) РО с эритроцитами 70,7+1,3 барана (Е-РО) РО с эритроцитами 16,5+1,0 мыши (М-РО) Больные острой пневмонией (25 чел.) 79,1+1,5 Е-РО (,05) 21,4+1,3 (,05) 33,2+1,6 64,7+1,5 29,9+2,2 12,6+1,3 14,8+0,9 9,9+1,1 26,3+1,569,9+1,724,3+1,6 (,05)(,05)(,05) 8,4+1,218,.1 + 1,28,2+1,3 (,05)(,05)(,05)

Объект имсследоваиия

Предпагаеидй Лимфоциты Нейтрофилы

Больные раком гортани (22 чел.) Е-РО Примечание: РПродолжение таблицы

Способ

Прототип

Лимфоциты Нейтрофилы достоверность различия средних значений показателей в группах больных по сравнению с группой §)с(оровык, полученная с использованием таблицы Стыодеита.