Способ определения активности фосфолипазы А. Советский патент 1989 года по МПК G01N33/68 

1

Изобретение относится к способам определения активности фосфолипазы А и может быть использовано в медицине и биологии, например, для определения активности панкреатической фосфолипазы при диагностике заболеваний поджелудочной железы.

Цель изобретения - повышение чувствительности, ускорение способа и возможность измерений активности в присутствии примесей в исследуемом образце путем измерения разности поверхностных потенциалов бислойной липидной мембраны для определения скорости ферментативного гидролиза.

На фиг. 1 - 3 приведены графические зависимости.

Пример 1. Построение калибровочной кривой дпя коммерческого препарата фосфолипазы А фирмы Калбио- хем (ФРГ).

Ячейку заполняют раствором 100 мМ КС1, 20 мМ имидазола, рН 8,9. Бислойные липидные мембраны формируют из раствора яичного фосфзтидил- холина в декане, В ячейку добавляют ЭДТА (до концентрации 0,2 мМ, Р оба отсека ячейки), через 2 мин - раствор фосфолипазы, через 2 мин - хлористый кальций (до концентрации 5 мМ, в оба отсека ячейки).

Результаты показаны на фиг. 1-3.

За единицу активности фермента принимают такую активность, при которой за 1 мин образуется 1 кМ жирных кислот. По калибровочным кривым, построенным для препарата известной активности, можно определять активность неизвестного препарата.

Величина фосфолипазнои активности может быть определена по формуле, основанной на электрохимической модели,

W AVVC ,

где V - скорость изменения поверхностного потенциала (В/с) на начальном участке (фиг. 1); ,4 К) ; С - концентрация Фонового этектролиС

tnaA

1

01

сд

та j W - активность фосфолипазы (количество моль жирных кислот, образующихся за 1 с на 1 м1 мембраны).

Пример 2, Определение фос- фолипазной активности панкреатического сока.

Измерения проводят так же, как и при построении калибровочной кривой (пример 1), но мембрану формируют из азолектина, а вместо фосфолипазы добавляют 10 мкл панкреатического сока человека, полученного при зондировании протока поджелодучной железы. Кинетика изменения поверхностного потенциала показана на фиг. 1. Величина активности, рассчитана по наклону начального участка кривой, 4 мВ/мин Тдля данных условий)

W 3.I

.

Такое же значение получается при проведении анализа в присутствии желчи (на 10 мкл панкреатического сока добавляют 10 мкл желчи).

Использование бислойной липидной мембраны в качестве субстрата и применение метода автоматической компенсации внутримембранного поля для

0

5

0

5

0

измерения поверхностного потенциала этой мембраны позволяет создать метод определения активности фосфолипазы А в растворе. Предлагаемый способ имеет более высокую точность и чувствительность, чем известный не требует тщательной очистки препарата и реагентов, может быть использован для измерений в присутствии примесей, позволяет проводить анализ быстро и с малым количеством образца.

Формула изобретения

Способ определения активности фосфолипазы А в растворе путем измерения скорости изменения поверхностного потенциала на бислойной липидной мембране при ферментативном гидролизе отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, ускорения способа и возможности измерения активности в присутствии приме- сей, измерение поверхностного потенциала осуществляют методом автоматической компенсации внутримембранного электрического поля, регистрируемой по отсутствию 2-й гармоники емкостного тока.

Изобретение относится к медицине и предназначено для определения активности фосфолипазы А. Цель - повышение чувствительности и ускорение способа. Измеряют скорость изменения поверхностного потенциала на бислойной мембране при ферментативном гидролизе методом автоматической компенсации внутримембранного электрического поля, которую регистрируюут по отсутствию второй гармоники емкостного тока. 3 ил.

W

72J

Концентрация фосфолипазы, усл. ед.

Фив. 2

MS/HUH

0.5

0.254

0.30.8

Концентрация, ml мл

0.9