Способ определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину Советский патент 1992 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к медицине, конкретно к способу определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину

Различные варианты вируса гриппа обладают разной чувствительностью к химио- терапевтическим препаратам. Вирус гриппа В устойчив к амантадину и проявляет слабую чувствительность к ремантадину. Вирус гриппа А характеризуется выраженной чувствительностью к этим препаратам, поэтому они широко используются в профилактике и лечении гриппа Однако не исключено появление вариантов вируса гриппа А нечувствительных к ремантадину. Поэтому в период массовых заболеваний гриппом целесообразно определять чувствительность конкретного варианта вируса гриппа, вызвавшего эпидемию.к ремантадину с целью рекомендации использования или не использования препарата в профилактике и терапии заболевания

Известно определение чувствительности вариантов вируса гриппа к ремантадину по ассоциации меченного матриксного белка (М-белка) вируса с липосомами в присутствии ремантадина

Недостатком известного способа является необходимость получения липосом, содержащих меченые 14С М-белки, меченого Н ремантадина, сложность и многоступен чатость процессов измерения

Наиболее близким предлагаемому способу является способ определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину с применением метода электрофореза Инкубированный с ремантадином вирусный белок чувствительного к ремантадину и резистентного вариантов вируса гриппа после предварительных процедур и подготовки к электрофорезу наносят на 10%-ный ПААГ После проведения фореза окрашивали гель амидочерным нарезали на полоски

Ё

VI

сл

по

о

Os 00

растворяли в 30%-ном растворе перекиси одорода. Затем измерили радиоактивость проб, нанесенных на бумажные миени. Наличие метки 3Н, обусловленной еченным тритием ремантадином, в проах, отвечающих локализации М-белка, видетельствует о связывании М-белка реантадина. Наличие такого рода ассоциа- циРГхарактёрно в случае чувствительного к ремантадину варианта вируса.

К недостаткам да нного метода следует отнести необходимость получения ремантадина, меченого тритием (что требует отработки специальной технологии в соответствующих условиях), необходимость проведения многочисленных операций по удалению не связавшегося -ремантадина, трудоемкостью процессов приготовления и последующей после фореза обработки геля, а также затратами времени на электрофорез.

Цель изобретения - ускорение анализа и упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

В один из отсеков измерительной ячей- ки установки для излучения электрических свойств бислойной липидной мембраны (БЛМ) вносят при постоянном перемешивании вирусный М-белок. При этом регистрируют значение разности граничных потенциалов БЛМ, сформированной на отверстии тефлоновой перегородки, разделяющей отсеки, заполненные солевым раствором. Полученное значение принимается за начальную точку отсчета. После этого в тот же отсек добавляют ремантадин (при перемешивании) и регистрируют изменение граничного потенциала мембраны Дух Результаты сравнивают со значением Др, полученным в аналогичных условиях при добавлении в ячейку той же концентрации ремантадина, но в отсутствие М-белка. Если измеренные таким образом скачки потенциала близки или совпадают, это говорит о том, что вирус, из которого выделен М-белок, устойчив к ремантадину. Превышение полученных значений контрольными свидетельствует о чувствительности вируса к ремантадину,

От прототипа способ отличается тем. что взаимодействие (связывание) М-белка вируса гриппа с ремантадином определяют по изменению разности граничных потенциалов БЛМ, которое наблюдается при ведении по одну из ее сторон в солевой раствор М-белка и ремантадина.

П р и м е р 1. Бислойную липидную мембрану (БЛМ) формировали по методу

Мюллер.-Рудина в тефлоновой ячейке с двумя отсеками на отверстии диаметром 0,8-1 мм из деканового раствора (50 мг/мл) L-a- фосфатидилколина фирмы Sigma. Водные

растворы содержали 5мМКС и 5мМКНаР04 (марки ХЧ), рН 7,4.

Вирусные М-белки выделяли из чувствительного и устойчивого к ремантадину штаммов вируса гриппа Контроль чистоты

и нативности М-белка осуществляли посредством электрофореза (пластинчатого) в 10%-ном ПААГ (полиакриламидный гель) в присутствии додецилсульфата натрия в течении 18-20 ч при силе тока 6-8 мА. М-белок

не содержал примеси других белков, не менял своей электрофоретической подвижности, располагаясь в той же зоне, в которой обычно распределяется М-белок вируса Измерения граничных потенциалов на

БЛМ проводили методом компенсации внутримембранного поля (КВП) с использованием второй гармоники емкостного тока. С помощью этого метода регистрировали разность граничных потенциалов ()с

обеих сторон мембраны.

В один из отсеков измерительной ячейки вносили при стабильном перемешивании вирусный М-белок (5 мкг/мл). При этом регистрировали значение разности граничных

потенциалов БЛМ, сформированной на отверстии тефлоновой перегородки, разделяющей отсеки, заполненные солевым раствором. Полученное значение принимали за начальную точку отсчета После этого

в тот же отсек добавляется ремантадин (при перемешивании) и регистрируют изменение граничного потеницала мембраны Ду Результаты сравнивают со значением Дуэ, полученным в аналогичных условиях при

добавлении в ячейку той же концентрации ремантадина, но в отсутствии М-белка (контроль). Если измеренные таким образом скачки потенциала близки или совпадают, то вирус, из которого выделен М-белок, устойчив к ремантадину. Превышение полученных значений Д над контрольными свидетельствует о чувствительности вируса к ремантадину. Для оценки чувствительности к ремантадину каждого данного варианта вируса гриппа достаточно внести по одну из сторон БЛМ в солевой раствор 5 мг/мл М-белка и 1 мМ рементадина О чувствительности вируса к ремантадину будет свидетельствовать превышение более чем на

10 мВ значений скачков потенциалов в присутствии М-белка над контрольными

Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами позволяет существенно упростить процесс

так как отпадает необходимость в нечетных радиоактивностью 4С М-белке и 3Н ремантадине, а следовательно, в необходимости специального оборудования условий для работ с радиоактивностью Отпадает необходимость в проведении многочасового электрофореза. Весь процесс измерения при наличии контрольной кривой занимает несколько минут.

Формула изобретения Способ определения чувствительности вируса гриппа к ремантадину путем выделе

ния белка-М ич вируса гриппа и инкубации белка-М в присутствии ремантадина, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени и упрощения способа, измеряют граничные потенциалы бислойной липид- ной мембраны после ее инкубации с белком- М и после инкубации в присутствии ремантадина и при увеличении потенциала мембраны более чем на 10 мВ в уравнении с потенциалом после инкубации ее с ремантадином, определяют чувствительность вируса гриппа к действию ремантадина.

Изобретение относится к медицине конкретно к способу определения чувстви тельности вируса гриппа к ремантадину Цель изобретения - ускорение анализа и упрощение способа В двухкамерную электрохимическую ячейку, разделенную бислой- ной липидной мембраной добавляют в одну камеру раствор белка исследуемого вируса гриппа, измеряют потенциал и при увеличении потенциала после добавления реманта дина вирус считают чувствительным к действию ремантадина. По сравнению с прототипом происходит сокращение времени анализа с н ескольких часов до 2-3 мин и упрощается cnocoja за счет использования электрохимической ячейки