Способ определения активности фосфолипазы А @ Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

Од СО

Изобретение относится к способам определения активности липолитических ферментов и может быть применено в биотехнологии, микробиологической промышленности, биофизике, биохимии, энзимологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа определения активности фосфолипазы А2.

Пример 1. Берут кювету с двумя отделениями, разделенными перегородкой (с отверстием в ней диаметром 0,9 мм) и заполненными раствором следующего состава, мас.%: трис - НС1 0,121; КС1 0,745г CaCla 0,011; дистиллированная вода - остальное рН 8,1. Затем на отверстии формируют азолектиновую бислойную липидную мем-брану (БЛМ) из 2%-ного раствора азолектина в декане путем отбора 0,005 мл раствора азолектина на пробу. Фосфолипа- зу А 2 добавляют в оба отделения кюветы и определяют время жизни азолектино- вой БЛМ (время регистрации электрического сопротивления БЛМ от момента добавления фосфолипазы А2 в оба отделения кюветы до разрыва мембраны) при воздействии на нее фосфолипазы А2, оно составляет t 24,8 мин (Rua.i - электрическое сопротивление БЛМ - составляет 2,5 х X 10 Ом). Получают концентрацию (активность) фосфолипазы А2, равную 1,8 X 10 г/мл (см. чертеж, кривая А).

Пример 2. Берут кювету с двумя отделениями и дальше все операции проделывают, как в примере 1. Диаметр отверстия 1,0 мм. Состав инкубационного раствора, мас.%: трис-НС -6,121; КС1 0,745; CaCla 0,001; дистиллированная вода - остальное рН 8,0. Фосфатидилхолиновую БЛМ формируют из 2%-ного раствора яичного фосфатидилхолина в декане, нанося на отверстие раствор фосфатидилхолина в количестве 0,003 мл на пробу. Добавляют фосфолипазу А2 в отделения кюветы и определяют время, жизни фосфатидилхоли- новой БЛМ прн воздействии на мембрану фосфолипазы А2, оно составляет 70 мин

(Кнач. 10 Ом). Получают концентрацию (активность) фосфолипазы А2, равкую 5,6- г/мл (см. чертеж, кривая Б). Пример 3. Берут кювету с двумя от- делениями и дальше все операции проделывают, как в примере 1. Диаметр отверстия 1,0 мм. Состав инкубационного раствора, мас.% трис-НС1 0,121; КС1 0,745; ,001; дистиллированная вода - остальное, рН 8,0. Фосфатидилэтаноламиновую

БЛМ формируют из 2%-ного раствора бактериального фосфатидилэтаноламина в декане, нанося на отверстие раствор фос- фатидиэтаноламина в количестве 0,003 мл на пробу. Добавляют фосфолипазу А2 в отделения кюветы и определяют время жизни фосфатидилэтаноламиновой БЛМ при воздействии на мембрану фосфолипазы А2, оно составляет 52,5 мин (RHa4 Ом). Получают концентрацию (активность) фосфолипазы А2, равную 5,6- 10 г/мл (см. чертеж,

кривая В).

Формула изобретения

25

Способ определения активности фосфолипазы А2, включающий формирование фос- фолипидной мембраны, инкубацию ее в роде, содержащей хлористый калий, растфор и ионы СА при рН 8,0 в присутствии раствора фосфолипазы А2 определенной концентрации с последующим изме3Q рением активности, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа и его упрощения, формируют плоскую бислойную мембрану на отверстии диаметром 0,9-1,0 мм, в разделяющей перегородке кюветы, сорстоящей из двух отсеков.

35 путем нанесения 1,9-2,0 мас.% раствори фосфолипидов в декане, инкубацию проводят в среде, содержащей 0,74-0,745 мас.% хлористого калия и 0.001-0,011 мас.% хлористого кальция, причем средой инкубации заполняют оба отсека кюветы, а активность определяют по времени жизни мембраны, регистрируя ее электрическое сопротивление.

40

Изобретение относится к способам, определения активности липолитических ферментов, предназначено для микробиологической промышленности, биотехнологии, биофизики, биохимии, энзимологии. Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа определения активности фосфолипазы А2. Для этого берут кювету с 2 отделениями, разделенными перегородкой (отверстие в перегородке0 0,9 мм), и заполняют р-рами следующего состава, мас.%: трис-НС1 0,121; KCI 0,745; CaCU 0,011; остальное - дистиллированная вода, рН 8,1. Затем отверстие закрывают азо- лектиновой бислойной липидной мембраной (БЛМ) из 2%-ного р-ра азолектина в декане путем отбора 0,005 р-ра азолектина на пробу. Фосфолипазу АО добавляют в оба отделения кюветы и определяют время жизни азолектиновой БЛМ (время регистрации электрического сопротивления БЛМ от момента добавления фосфолипазы АО в оба отделения кюветы до разрыва мембраны). § 1 ил. (Л