Способ определения активности протеолитических ферментов Советский патент 1982 года по МПК C12N9/52 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

1

Изобретение относится к микробиологии, а более конкретно к способам исследования ферментов.

Известны способы определения активности протеолитических ферментов, основанных на гидролизе субстрата с образованием продуктов ферментативной деятельности и последующим выявлением этих продуктов. Например, для определения ферментативной активности в диализный мешок помещают биологически активную жидкость и исследуемый продукт, содержащий буфер и химический субстрат. В результате реакции получается диализируемый продукт распада субстрата. Мешок погружают в раствор, при этом продукты ферментативной деятельности ди(})фундируют через мешок в раствор, в котором определяют активность данного фермента 1.

Известен способ качественного определения активности протеолитических (ерменния активности протеалитических ферментов Сущность способа заключается в следующем: рентгеновская пленка фиксируется тиосульфатом натрия и после промывания

тщательно высушивается, испытуемый раствор наносится на пленку, помещается во влажную камеру, инкубируется. Затем пленка промывается, высушивается и красится амидочерным 10 Б. После этого пленка промывается 1%-ной уксусной кислотой 2.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения активности протеологических ферментов, предусматривающий приготовление на чашках

10 Петри агаровых пластинок с добавлением белкового субстрата, нанесение пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением.

Процесс определения активности провоfs дится в следующей последовательности: на засты-вший агар наливается раствор казеина, который оставляется на полтора часа для диффузии последнего в агар. Специальной полой трубкой в агаре делаются лунки, которые заполняются испытуемым фермент20ным раствором. Инкубация проводится в термостате во влажной камере в течение 18-20 ч. Для облегчения чтения результатов белок в агаре фиксируется трихлоруксусной кислотой. При этом фон становится молочно-белым, а вокруг лунки образуется ореол просветления 3.

Недостатком метода являются его трудоемкость, продолжительность, необходимость проведения подготовительных операций: диффузии субстрата в агар и изготовления лунок.

Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса определения протеолитической активности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности протеолитических ферментов, предусматривающему приготовление на чащках Петри агаровых пластинок с добавлением белкового субстрата, нанесение на пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением, раствор субстрата непосредственно вносят в расплавленный агар, размешивают, разливают в чащки Петри, На застывщий агар накладывают диски фильтровальной бумаги, на которые наносят исследуемый раствор фермента, а инкубацию проводят в термостате в течение 9- 11 ч.

Технология способа состоит в следующем.

Приготавливают раствор субстрата, вносят , его в расплавленный и остывщий до 60°С агар, устанавливают рН исследуемой протеиназы (для кислой протеиназы 3,5, для нейтральной 7). Приготовленную смесь разливают в чащки Петри по 10 мл и оставляют диски фильтровальной бумаги диаметром 10 мм. На диски наносится исследуемый ферментный раствор по 0,1 мл. Для предохранения фермента от подсыхания На крыщку чащки Петри накладывают фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой. Чащки инкубируются в термостате при 37°С 9-11 ч. По истечении указанного времени диски фильтровальной бумаги удаляют с агара, а агаровые пластинки проявляют Ю /о-ным раствором трихлоруксусной кислоты или 5%-ным раствором соляной кислоты. При этом поверхность агара приобетает молочно-белый цвет. На месте удаленных дисков при наличии активного протеолиза обнаруживаются хорощо выраженные прозрачные зоны.

Пример 1. Определяют активность нейтральной протеиназы, выделенной из Erwinia carotovora f. citrullis щтамп № 603 на казеине. Для приготовления 100 мл субстрата с казеином в 80 мл дистиллированной воды растворяют 1 г агара «Дифко, а 20 мл воды используют для приготовления раствора казеина. 1 г казеина фирмы «Реанал заливают 4 мл воды и оставляют для набухания. Затем казеин ставят на водяную баню при 60°С, по каплям добавляют 2 М раствора едкого натра (6 капель), затем наибольщими порциями приливают оставщуюся воду и выдерживают в бане до полного растворения казеина. Готовый раствор казеина смещивают с остывщим до 60°С агаром. Устанавливают рН 7. Далее проводят операции по описанной выще технологии. Время, затраченное на анализ, равняется 11 ч. Активность нейтральной протеиназы обнаруживается по хорощо выраженным зонам.

Пример 2. Определяют активность кислой 0 протеиназы, выделенной из Erwinia carotovora . citrullis щтамм № 603, на альбумине. Для приготовления субстрата бычий альбумин растворяют в дистиллированной воде при комнатной температуре и смещивают с остывщим до 60°С агаром (в растворе должно содержаться 1% альбумина и 2% агара «Дифко). Устанавливают рН среды 3,5 и проводят операции по описанной выще методике. Об активности протеолитического фермента судят по хорощо выраженным прозрачным зонам на месте удаленных дисков фильтровальной бумагой.

Пример 3. Определяют активность пепсина на гемоглобине. Субстрат с гемоглобином приготавливают аналогично альбумину. Через 10 ч инкубации обнаруживают активныи протеолиз.

Пример 4. Определяют активность трипсина на желатине. Для приготовления субстрата растворяют в 20 мл бидистиллированной воды на водяной бане при 60°С и смещивают с остывщим до 60°С агаром. Далее проводят операции по описываемому способу. Время анализа 10-11 ч. Отмечен активный протеолиз.

Таким образом, реализация изобретения позволяет упростить и ускорить процесс определения активности протеолитических ферментов.

Формула изобретения

Способ определения активности протеолитических ферментов, предусматривающий приготовление на чащках Петри агаровых пластинок с добавлением белкового субстрата. Нанесении на пластинки ферментного раствора с последующей инкубацией и проявлением, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, раствор субстрата непосредственно вносят

Q в расплавленный агар, размещивают, разливают в чащки Петри, на застывщий агар накладывают диски фильтровальной бумаги, на которые наносят исследуемый раствор фермента, а инкубацию проводят в термостате в течение 9-11 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент США № 3243147, кл. С 12 D опублик. 1968. 2. Рябушко Т. А., Вечер, А. С. Прикладная биохимия и микробиология. Т. 1, 1965, в. 6, с. 645-652. 3. Смирнова М. Н., Акимова В. В., Бурштейн В. А. «Лабораторное дело, 1972, № 10, с. 611-612 (прототип).