Способ получения @ -2-амино-4-метилфосфиномасляной кислоты Советский патент 1986 года по МПК C12P13/04 

IS

20

1 ,124689

Изобретение относится к производтву аминокислот, а именно к способу олучения Ь-2-аьшно-4-нетилфосфино- асляной кислоты ферментативным путем.

Целью изобретения является повы- 5 ение выхода изомера L-фосфинотрицина.

Способ осуществляется следующим бразом.

Готовят водный раствор N-арилаце- ильного производного общей формулы 10

О

и

СНз-Р-СН 2-СН2-Ш-БН-СО СН -Аг

ОН СООН

где Аг - фенил,

и осуществляют ферментативньй гидролиз ацилазой, в качестве.которой ис- польззпот пеницйллин-С-ацилазу, вьще- ленную из Escherichia coli AMCC 11105. Затем после окончания процесса из образовавшейся смеси, состоящей из Ь-2-амино-4-метилфосфиномасляной кислоты (L-ФТЦ), N-фeнилaцeтил-D-2-aмй- но-4-метил-фосфиномасляной кислоты - (N- фенилацетш1-В-ФТЦ) и фенршуксус- ной кислоты, можно вьщелить L-ФТЦ, отличающуюся высокой степенью чистоты.

Пример 1. Берут 10 г (33,4 ммоль) К-фенилацетил-В,L-ФТЦ и суспендируют в небольшом количестве дважды дистиллированной воды. Затем доводят рН суспензии путем добавления 1 н. раствора гидроокиси натрия до 7, 8, после чего добавляют дистиллированную воду до получения 500 мп раст- 35 вора.

В него вносят 15 мг пенициллин-С- -адилазы в виде лиофилизата, вьщелен- ной из Escherichia coli AMCC 11105, и полученную.реакционную смесь выдер- 40 живают 15 ч при комнатной температуре, после чего отбирают пробу и устанавливают путем окрашивания ее нин- гидрином содержание свободной аминокислоты. В данном случае степень 45 превращения составляет около 50%. Затем с помощью концентрированной соляной кислоты доводят рН смеси до 2,0- . 3,0, фильтруют и полученный прозрачный раствор субстрата пропускают че 50 рез колонку, заполненную 150 г Day- enca (R) 50 W X 2 (Н -форма) .

После этого колонку промывают .нодой до выхода из нее нейтрального н не содержащего ионов хлора элюата, .4 затем 0,8 н.раствором хлористого водорода в смеси с этиловым спиртом

S

0

89

0

5

0 5 0

5

..2.

и водой из колонки вымывают свободную аминокислоту в виде гидрохлорида.

Из упаренного элюата получают чистый гидрохлоридФТЦ с т.пл. 199-200 С. Выход составляет 3,3 г (15,2 ммоль) 45,4%).

Из гидрохлорида путём обработки окисью пропилена получают свободную кристаллическую Ъ-аминокислоту с тлш. 217-219 0 и удельным углом вращения +28° .

Пример 2. Берут 60 г (200,5 мм:оль) N-фенилацетил-D,,L-ФТЦ и смешивают с небольщим .количествсбм воды. Затем раствором гидроокиси натрия доводят рН суспензии до 8,0, После этого добавляют воду до объема суспензии, равного 1,0 л, и смешивают- с фиксированной пенициллин-С-аци- лазой (активность примерно равна 80 V/г). Полученную реакционную смесь перемешивают 1,5 г, а затем отделяют фильтрацией нерастворимый в воде катализатор. Полученный фильтрат пропускают через колонку, заполненную 750 г сильно кислотной кати- онообменной смолы.

Дальнейшую обработку раствора ведут по примеру 1.

В результате получают 20 г (92 ммоль 46%) гидрохлорида с т.пл. 199-201 С, удельным углом вращения ) 23,3° и молярным вращением f 50, 7.

Полученная после обработки гидрохлорида окисью пропилена свободная L-ФТП имеет т.пл. 216-217°С, удель- лый угол вращения +28,5° и молярное вращение 1|и 51,6°.

Пример 3. С целью исследования стабильности, связаннойс носителем пенициллин-С-ацилазы, используемой в примере 2, по отношению к N-фенил- ацетрш-В Ь-ФТЦ,. 100 мг фиксированншго фермента смешивают с 10 мл 5%-ного водного раствора М-фенил-ацетил-В, L-ФТЦ (рН суспензии стабилизируют на уровне 7,8 путем добавления фосфатного буфера), Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре. Через 24 ч раствор субстрата фильтруют, отделяют фермент и вновь смешивают с раствором субстрата.

Активность фермента измеряют по содержанию свободной ФТЦ через 45 мин и через 22,5 ч. путем окрашивания проб

НИНГИД ЗИНОМ.

Значительного уменьшения стабильнфс- ти. связанной с носителем пенициллин31246897

-G-амилазы, не было обнаружено спустя 8 недель. В каждом случае через 45 мин с начала реакции гидролизовалось около 20%, а спустя 22,5 ч около 50% в расчете на примененную рацемическую 5 сйесь. рН

050

нат

жив

1 М

50

Пример 4. Для получения фиксированной пенициллин-С-амилазы берут коллагеновые мембраны, их активируют по методике Кулэ, а затем смачивают 2 мл раствора пенициллин-С-амилазы, содержащего О,1 моль фосфата калия с

Редактор А.Шандор Заказ 4030/60

Составитель М.Андреева

Техред Г.Гербер Корректор Г.Решетник,

Тираж 490 . Подписное ВНИЖИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, А

4

Мембраны в этой смеси выдер- 4 ч при 4 С, а затем промывают

рН 8,0, 0,25 моль ацетата начрия, и

05024%-ным раствором водного азида

натрия.

живают

1 М раствором хлористого натрия и

50 ммоль кал1йфос фатного буфера (рН

равна 7,0).

Полученный материал вводят в реакцию описанным в npi-mepe 2 образом с 60 г N-фeнaцeтил-D-L-ФTЦ. В результате получают L-ФТЦ с тем же уровнем оптической чистоты, что и гидрохлорид L-ФТЦ по примеру 2.