Способ получения @ -молочной кислоты Советский патент 1985 года по МПК C12P7/56 C12R1/225 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения D-молочной кислоты сбраживанием Сахаров. Известен способ получения;0-молоч ной кислоты путем сбраживания глюкозы или свеклосахарной мелассы в присутствии питательных минеральных солей штаммом Lactobaciflus leichman nil AMCC 4797. Выход за 60 ч составляет г D-молочной кислоты 1. Наиболее близким к изобретению является способ получения D-молочно кислоты,заключающийся в сбраживания глюкозы или лактозы молочного сахара бактериями рода LactobacM lus на питательной среде в присутствии источника азота, карбоната кальция, регулирующего рН среды, и других питательных минеральных солей в анаэробных условиях при рН предпочтительно 5,1 и температуре до 50°С с последующим выделением 0-молочной кислоты. Выход кислоты составляет до /О г 2. Целью изобретения является повышение выхода 0-молочной кислоты. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения О-мо.лочной кислоты, предусматривающему сбраживание глюкозы или лактозы бактериями рода Lactobaci1lus в присутствии источника азота, регулятора- рН и других питательных минеральных солей в анаэробных условиях при рН 4,5-7,0 и 30-50°С с последующим выделением целевого продукта из бактерий рода LactobaciI1 us использую рлтаммLactobaci I lus bulgaricus DSM 2129. . Используемые для получения D-моло ной кислотыштамм Lactobaci1lus bulgaricus DSM 2129 выделен из подкисленной молочной пробы и улучшен планомерной селекцией таким образом что продуктивность его за 48 ч дости гает 115 г/л.молочной кислоты. Штамм депонирован в немегусой коллекции микроорганизмов под номером DSM 2129. Идентификация штамма показывает, что он состоит из длинных грамположительных палочек, отрицательных к каталазе, неподвижных, микроаэрофил ных, Виохиги Ические характеристики. Обмен веществ. Гомоферментативное молочнокислое брожение: 5 газ из глюкозы газ из глюконата рост при 15 с рост при 45°С + Образование кислоты из: рибозыарабинозы ксилозыманнита сорбитаглюкозы + галактозы- лактозы + мальтозы сахарозы трегалозы целлобиозы мелибиозы раффинозы салицина амигдалина Расщепление аргинина : -.: Конфигурация молочной кислоты: D /-/. Диаминопимелиновая кислота в стенке клетки: никакой. Штаг-1м LactobacMlus bulgaricus DSM 2129 не специализирован на брол ении глюкозы, а может сбраживать (ферментировать) молочный сахар почти так же быстро, как и глюкозу, до молочной кислоты. Таким образом, имеющуюся в больших количествах, в. качестве отходов молочной промыщленности, свежую молочную сыворотку или в виде суспензии порошка молочной сьшоротки можно использовать в качестве источника сырья для производства D-молочной кислоты. Используемые для получения D-молочной .кислоты питательные среды составляются известным образом. Они наряду с глюкозой и/или молочным аахаром содержат также источник азота, например М51сной экстракт, кукурузную набухающую в воде муку (.Cqrnstupj или соевую муку. Кроме того, добавляют минеральные соли, витамины и поверхностно-активные средства. В качестве поверхностно-активных средств используют продажные неионные поверхностноактивные вещества, прежде всего жидкие продукты. Эти поверхностно-активные вещества содержат в качестве биологически активного вещества полиоксИалкнлаты, например продукты взаимодействия спиртов и кислот с этиленоксидом и/или пропиленоксидом.

В качестве спиртов используют однои многоатомные спирты. Такие,как жирные спирты смоляные спирты, глицерин, , пентаэритрит; или сахарные спирты, такие как сорбит, и маннит; в качестве кислот прежде всего используют жирные и смоляные кислоты. Благоприятны также неполные сложные эфиры из таких многоатомных спиртов и указанных кислот, как оксиэтилаты ангидросорбит-моноолеата.

Так как LactobaciHus bulgaricus DSM 2129 чувствителен к кислотам, то образующуюся молочную кислоту нужно связьгоать с помощью гидрооксидов, или карбонатов щелочных или щелочноземельных металлов, в особенности карбонатом кальция. рН-Значение, таким образом, поддерживается в области 4,5-7,0, предпочтительно 6,56,8.

Любую питательную среду перед посевом Lact.obaci 1 lus bulgaricus DSM 2129 стеарилизуют, чтобы устранить возможные загрязнения за счет посторонних организмов. Дпя этого достаточно нагреть питательную среду в течение 15 мин при 121°С.

Как и для всех молочнокислых брож ний (ферментации),для предлагаемого способа требуются анаэробные условия. Для этого достаточно образующейся благодаря нейтрализации молочной кислоты карбонатом кальция, двуокиси углерода или обогащения ферментационной среды азотом.

Молочнокислое брожение осуществляют в температурном интервале 30-50 С. Особенно благоприятный температурный интервал 40-45С.

Из осаждающейся по предлагаемому способу соли 0-молочной кислоты можно получить свободную 0 молочную кислоту с помощью ионообменника или в случае лактата кальция путем подкисленйя серной кислотой.

Пример 1. Рост штамма Lactobacillus bulqarlcus DSM 2129.

Находящийся в пробе сброженного молока шсамм LactobaciHus bulgaricus выделяют и культивируют в следующей среде 1, г/л:

Казеиновый пептон

(триптич|ски усвоенный)10

Мясной экстракт

(Merck)JO

Дрожжевой экстракт 5

Глюкоза20

2 5

КгНРО

Ацетат натрия MgS04.7H20

0,2 MnSO .N30 0,05

Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/л Затем пробы штамма разбавляют и производят посев на агаровые пластинки, которые приготовлены из той же среды с добавкой 1,8% агара. Инокулированные агаровые пластинки затем в течение дня выдерживают при в анаэробных условиях в термостате.i 5 В целом затем извлекают 30 отдельных колоний и, смотря по обстоятельствам, вносят в пробирку, которая содержит следующую среду 4, г/л:

Глюкоза50

0 СаСО70

Дрожжевой экстракт 7 Кукурузная набухающая мука (сухая) 15 Ацетат натрия5

5 Неионное поверхностноактивное вещество .1 мп/л Время культивирования составляет 24 ч при 45С. Спустя 24 ч отчетливо виднаразница между различными , 0 хорошо сброженными культурами и обраковавшимися количествами О-молочиой кислоты. Пробирку с самым большим количеством D-молочной кислотыисполы зуют для нового мазка на стекле. Этот . процесс повторяют регулярно в течение 8 нед., и при .этом содержание сахара в среде повышают сначала до Р, 87, и спустя следующие 5 нед. до 10%. Затем штамм селекционируют следующие 0 12 иед. до тех пор, пока он не станет способен метаболизировать 100 г глюкозы/л среды в течение 24 ч на 65%, причем образуется 55 г D-молочной кислоты/л. Полное разрушение глюS .козы наблюдается спустя 36-40 ч.

П р и м е р 2. Полученный согласно примеру 1 «штамм LaetobacF1lus bulgaricus помещают в пробирки, которые содержат по I5 мл среды. Пробирки 0 для культуры ставят вертикально при 45°С по меньшей мере на 8 ч и самое . большее на 20 ч и затем используют в качестве инокулята для культур в колбах Эрленмейера, которые родерзкат 5 по 250-мл среды 1. Их также вьадерживают при45°С 8-20 ч. Содержимое 6 указанных колб Эрленмейера затем служит в качестве инокулята для фермеита емкостью 30 л, в которьш предварител но помещена следующая среда 2, г/л: Глюкоза30 Дрожжевой экстракт Казеиновый пептон Кукурузная набухающая мука (сухая)20 Ацетат натрия5 Нсионное поверхностноактивное вещество 1 мл/л Ферментеры перемешивают со скоростью iOO об/мин, п спустя 8- 2 ч при 45°С в ферментер загружают содер в количестве 270 л, которое содержит либо указанную п прш-iepe 1 среду, либо следующую среду 3, г/л: Глюкоза30 СаСОз70 Дрожжевой экстракт 7 Соевая мука15 Ацетат натрия5 Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/л После выращивания культуры, т.е. спустя 7 ч, добавляют еще глюкозу. При добавлении глюкозы руководствую ся потреблением глюкозы и образовани ем кислоты. В целом в течение пример но 45 ч добавляют такое количество глюкозы, которое составляет примерн 10 вес.% питательной среды. Из глюкозы образуется И 5 г 0-молочной кислоты питательной среды (равно 166 г лактата кальция). Выделение свободной молочной кислоты осуществляют известными способами, а именно осаждением кальция серной кислоты, фильтрацией, выпариванием и очисткой,путем перегонки в виде слож иого этилового или метилового эфира Применение среды 3 имеет то прей мущество, что в целевом продукте не содержится обнаруживаемого количест ва L-молочной кислоты. Среда 4 имее прекмугцество в том, что она после ферме {тации лучще фильтруется, чем среда- 3, так как соевая мука в сред 3 разрушается только . Полу ченный с помощью среды 4 продукт содержит 2% L-молочной кислоты, которая происходит из кукурузной набухающейся муки в среде. После фильтрации возможно расщеп ление доли 1 молочной кислоты путем пропускания фильтрата через ферментивный реактор, который содержит фермент, расщепляющий специфически L-молочную кислоту. Пригодны системы с L-лактатоксидазой, L-лактатдегидрогенавой или цитохромом bj LЛактатдегидрогеназа нуждает ся в качестве кофактора в NAD, который также может быть связан с носителем и затем может, регенерироваться и применяться вновь. Для цитохрома Ъ пригоден в качества кофактора гексацианоферрат, который может снова повторно окисляться с помощью электри- ческого тока на электроде из благородного металла. П р ер 3. Согласно указанному в npro-tepe 2 способу готовят штаммкультуру и инокулят, однако в качестве питательной -среды применяют следующу о среду 5, которая содержит молочный сахар в качестве сбраживаемого субстрата, г/л: Порощок молочной сьторотки60 Дрожжевой экстракт Соевая мука5 Ацетат натрия . 5 Неионное поверхностноактивное вещество 1 мл/л Как и в примере 2, после выращивания культуры добавляют дополнительно сахарный субстрат, а именно до. тех пор, пока добавленное в целом количество молочного сахара -не составит 130 г/л. Образование молочной кислоты длится несколько дольше, чем в примере Z, однако спустя 50 ч . заканчивается. В .остальном поступают описанным в примере 2 образом. Выход D-молочной кислоты составляет ЮО г/л. П р им ер 4. Штаммовая культура и инокулят готовятся при насыщении азотом, как в примере 1. Используют среды 3,4 или 5, однако они сначала не содержат CaCOj.Его в сухом виде или в виде 20%-ной суспензии добавляют потом, так, чтобы рН не снижалось ниже 5,5. Спустя 48 ч Начинают дополнительное дозировяние питательного раствора. Ско- , / рость разбавления составляет 0,01 л/ч на литр питательного раствора, причем равные количества жидкости непрерьгано извлекают из ферментера. Скорость разбавления медленно увеличивают до величины 0,04 л/ч на литр питательного раствора, причем слив из ферментера имеет -содержание D-MOлочной кислоты 5-7%. Клеточную массу непрерьгонр отдел5шт от слива с помопц ю непрерьшно функционирующего сепаратора и на 9и% возвращают в ферментер. В вьщеленной части устанавливают рн 6,5 с помощью гидроксида кальция и упаривают до 1/10 ее пер- воначального объема. В низкотемпературной ловушке концентрат охлаждают до , при этом выкристаллизовьшается.лактат кальция. Концентрированный раствор непрерьтно подают в низкотемпературную ловушку, в то время как осадившийся лактат кальция выводят в регулярные интервалы с помощью шибера. ма точный раствор возвращают в ферментер. Выделение молочной кислоты из полученного лактатл кальция осуществляется с помощью серной кислоты и путем последующей фильтрации, Выход составляет 110 г D-молочной кислоты на литр питательной среды. П р h м е р 5. Повторяют непрерьшное получение молочной кислоты

согласно примеру различием, ,что для регулирования рН используют не СаСОд, а гидроксид натрия. Преимущество этого способа заключается в том, что он позволяет поддерживать рН при 6,5-6,8, благодаря чему ско рость брожения LactobacI1lus Dulaaricus DbM .повыщается. Образовайщийся раствор лактата натрия пропускают через ионообменные колонки, которые абсорбируют молочную кислоту. Как только колонка будет загружена молочной кислотой, последнюю элюируют соляной кислотой. После регенерации разбавленным раствором гидроксид да натрия колонку снова можно иcпoлiзовать для адсорбции молочной|кислоты. Выход D-молочной кислоты 115 г на литр питательной среды.

Использование предлагаемого способа обеспечивает более высокий выход целевого продукта и его оптически чистым.

СПОСОБ ПОЛУЧьНИЯ 13-МОЛрЧНОЙ . Кислоты путем сбраживания глюкозы или лактозы бактериями рода LactobacHlOs в присутствии источника азота, регулятора рН и других питательных минеральных солей в анаэробных условиях при рН 4,5 - 7,0 и температуре 3050 С с послепутшим выделением целевогЪ гфодукта, отличающийс я тем, что, с целью повьшения в ыхода кислоты, из бактерий рода Lactobaci Mus используют штамм .Lactobacillus bulgaricus DSM 2129.