Способ получения пептида-ингибитора желудочной секреции Советский патент 1986 года по МПК A61K35/20 C07K1/14 

Изобретение относится к препаративной биохимии, в частности к способам получения ферментов.

Цель Ii3o6pe тения - повьшение ингй биторной активности пептида за счет проведения дополнительной очистки с использованием ступенчатого градиента рН, создаваемого натрий-цитратным буфером на катионообменнике дауэкс 50x2 и повторной гельфильтрации на сефадексе G-10.

Пример 1. Для выделения ингибитора проводят получение ферментативного гидролизата эе-казеина и выделение пептида - ингибитора желудочной секреции кислоты.

Получение, ферментативного гидролизата эе -казеина.

К 8 л обезжиренного молока прибавляют по каплям раствор 1 н. соляной кислоты при постоянном перемешивании до рН 4,6 оставляют формироваться осадок казеина в течение ночи на холоде (5-3°С), отделяют от сыворотки фильтрацией через ткань. Вес осадка 1000-1200 г.

Из общего казеина выделяют эе -казеин. Для этого навеску сырого казеина (1200г) растворяют в.мочевине (конечный объем 3 л; концентрация мовечины - 6,6М), добавляют 6 л дистиллированной воды и при постоянном перемешивании прибавляют 7 н. раствор серной кислоты до рН 1,5 и оставляют Для формирования осадка на 3-4 ч при комнатной температуре. Осадок отделяют фш1ьтрова1шем через бумажные складчатые фильтры или центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 мин и отбрасыв1ают. Из фильтрата (центрифугата) высаливают эе-казеин сернокислым аммонием (при концентрации 132 г на 1 л фильтрата) и оставляют формироваться осадок в течение 1 ч, а затем отделяют фильтрованием через бумажные фильтры. Осадок эе-казеина (120 - 140г) растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при подще- лачивании 5 н. раствором гидроокиси натрия до рН 8,0 и освобождают от сернокислого аммония диализом против 0,04%-ного раствора хлористого натрия.

В полученном после диализа растворе эе -казеина определяют концентрацию белка по калибровочной кривой зависимости оптической плотности при

2470132 .

длине волны 280 нм от концентрации ЗС-казеина, разбавляют дистиллированной водой до 4%-ной концентрации продукта и прибавляют хлористый кальций

5 до концентрации 0,8г на 100 мл раствора. Доводят рН раствора до 5,65 1 н. раствором соляной кислоты, прибавляют навеску пепсина, растворенного в небольшом количестве воды,

10 чтобы фермент-субстратные отношения бьти равны 1:200, и инкубируют 120 с при . Из ферментативного гидролизата удаляют интактный белок и крупные полипептидь осаждением их

15 трихлоруксусной кислотой с конечной концентрацией 12%. Осадок отделяют фильтрованием через бумажный фильтр и отбрасывают, а фильтрат разливают в целлофановые мешочки и проводят

20 диализ против дистиллированной воды.

Полноту диализа устанавливают по . значению рН, которое должно стать нейтральным. Образец лиофилизуют. .Выход составляет 1200 мг. Получен25 ную супернатантную фракцию гидролизата подвергают фракционной очистке.

Выделение пептида - ингибитора желудочной секрецщ кислоты.

30 200 мг полученной на предыдущей стадии лиофилизованной супернатант- ной фракции гидролизата в 2 мл 0,01 М раствора аммиака разделяют на колонке- сефадекса G-75 (1,5 х

35 X 85 см),уравновешенной раствором аммиака, со скоростью 60 мл/ч. Собирают фракции по 3 мл. Выход материала, с колонки на всех стадиях разделения регистрируют с помощью регист40 ратора измерений электропроводности и процента поглощения света -РЭШ1С - 1М при длине волны 260 нм и автоматически записьюают на самойисце КСП-4. Материал, выходящий на хрома 5 тограмме вторым пиком (Б-пйк) в объеме 140-190 мл, собирают и лиофилизуют. Он составляет 65% от нанесенного на колонку образца. 250 мг Б-пика в 2,5 мл 0,ОШ раствора аммиака разде50 ляют на колонке сефадекса G-25

(1,5x105 см) в 0,ОШ растйоре аммиака со скоростью 60 мл/ч. Собирают фракции по 2 мл. Материал, выходящий на хроматограмме третьим пиком .

55 (53-пик) в объеме 160-190 мл, собира- .ют и лиофилизуют. Он составляет 15,2% от нанесенного на колонку образца.

200 мг БЗ-пика в 2 мл 0,ОШ раствора аммиака разделяют на колонке сефадекса G-10 (1,5х70см) в 0,01 М растворе аммиака со скоростью 25 мл/ч. Собирают фракции по 2,5 мл Материал, выходящий на хроматограм ме вторым пиком в объеме 75 - 95 мл (Б32-ПИК) , собирают и лиофилизуют.. Он составляет 48% от нанесенного на колонку образца.

120 мл Б32-пика растворяют в 4 м стартового 0,2 М натрий-цитратного буфера 2,2 и наносят на колонку с к тионообменной смолой дауэкс 50 х 2 (200-400 меш), размером 2,5x40 мм, уравновешенную этим же буфером. Элю цию проводят со скоростью 30 мл/ч сначала стартовым буфером в объеме 120 мл, после чего переходят на 0,2 М натрий-цитратный буфер рН 3,2 которым элюируют также 120 мл, после чего сменяют его на 0,2 М натрий цитратный буфер рН 4,25 и собирают пик, выходящий на хроматограмме в этом градиенте рН пятым (V-пик) с начала хроматограммы в объеме 300 - 350 мл.

Натериал V-пика лиофилизуют, растворяют в 4 мл 0,01 М раствора аммиака и наносят на колонку G-10 (1,5 X 100 см), уравновешенную 0,ОШ раствором аммиака. Скорость фильтрации 15 мл/ч. Собирают фракции по 2 мл. Материал, выходящий на хроматограмме первым пиком в объеме 55 - 90 мл (V-1-пик), представляет собой конечный препарат. Его собирают и лиофилизуют. Выход образца 8,3% от нанесенного пика Б32.

По мере очистки препарата опреде- ляют ингибиторную активность фракций в остром опыте на крысах с перфузи- руемым желудком, находящихся под уретановым наркозом. В основе методики тестирования метод непрерывной количественной регистрации соляной кислоты в желудке. Белых крыс самцов линии Вистар массой 180 - 200г, голодавших 18-20 ч, анестезируют внутрибрюшинным введением уре- тана в дозе 1,5-1,75 г/кг массы тела. В полость.желудка вводят канюли для перфузии. Перфузию осуществляют с помощью перестальтического насоса 10 мМ трис-НС1 буфером рН 7,4 7,5, подогретым до 37°С. Скорость перфузии 40 мл/ч. В перфузате непрерывио определяют концентрацию прото-

10

25

5 20

о 5

30

5

нов с помощью иономера ЗБ-74, оснащенного термостатируемой проточной кюветой. Данные измерения автоматически записьшаются на самописце КСП-4. Величину секреции кислоты желудком вычисляют по площади пика или впадины, записанной на ленте самописца, и относят ко времени,,за которое оно произошло, и к массе животного.

Оценку ингибиторного действия выделяемых пептидных фракций производят по их способности снижать стимулированную инфузией пентагастри- на желудочную секрецию кислоты.Пен- тагастрин инфузируют через полиэтиленовый катетер в вену нижней конечности в количестве 0,5 мкг.ч. При выходе секрехщи на постоянный уровень вводят исследуемые пептиды внутривенно в дозе 0,2 - 10 мг на животное.

П р и М е р 2. Проводят аналогично примеру 1, только фракция Б32 дважды подвергалась хроматографии на колонке с сефадексом G-1О. При этом удельная ингибиторная активность соответствующих фракций существенно не увеличилась. После первой рехроматографии фракция (Б -32) при дозе 3 мг на животное вызывала снижение на 40% стимулированной пен- тагастрином секреции кислоты, а после второй рехроматографии фракция (Б -32) в такой же дозе снижала секрецию на 47%.

В таблице представлены данные по ингибиторной активности пептидных фракхщй гидролизата по мере очистки и выделения препарата

Супернатантная

фракция

гидролизата

Б32 V-1

10

3

0,3

20 37 93

$ 12470136

Продолжение таблицы Как следует из таблицы, введение дополнительной стадии очистки ионо- - обменной хроматографией с последующим разделением гельфильтрацией приg 02 3 ДО вело к 2-кратному возрастанию активности препарата, в то время как исг, 00 о л пользование только гель-хроматогра- ь -J/ j ц/ , „

фической очистки не дает повьшения

активности.