Способ выделения ингибитора ангиотензин-1-превращающего фермента из яда животного происхождения Советский патент 1992 года по МПК C07K3/12 C07K7/10 C07K7/20 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения биологически активного белка, который может быть использован в медицине как потенциально- терапевтическое средство антигепертен- зивной направленности.

Известны пептиды с ингибирующей ак- тивностью к АПФ, выделенные из яда змеи Bothrops jararaca.

Способ выделения представлен на схеме (фиг. 1). Как видно из схемы, выделение пептидов из яда змеи Bothrops jararaca проводится поэтапно путем гель-фильтрации цельного яда на сефадексе G-25 (элюант - 0,2 М уксусная кислота), полученную активную фракцию подвергают ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе ОИ-52, причем элюцию проводят ступенчато от 0,005 до 0,2 М аммонийацетатным буфером, после получения двух фракций, первую, обладающую ингибирующей активностью, делят на ионообменнике - ДЕАЕ-сефадексе, элюируя аммонийбикарбонатным буфером при линейном градиенте от 0,005 до 1М,

v| 00 О

о

00 00

затем отбирают одну из полученных 10 фракций, обладающую ярко выраженной ингибирующей АПФ-активностью, и подвергают ее гель-фильтрации на сефадексе G-25 в этилацетатном буфере; для выделения наиболее активного и гомогенного пептида используют электрофорез на бумаге.

Полученный пептид-ингибитор характеризуется Cso, равным 0,3 мкг/мл.

Как видно из приведенной схемы (фиг. 1), способ выделения этого пептида трудоемок, необходимо приготовление разнообразных буферных растворов, при этом полученный пептид обладает низкой активностью.

Цель изобретения - повышение ингибирующей активности.

Цель достигается получением белка-ингибитора фермента АПФ, содержащего 94 аминокислотных остатка, с мол. массой 10 кДа, изоэлектрической точкой Р; 4,7 с N-концевым остатком - глутаминовой кислотой путем выделения цельного яда из экстракта гомогената ядовитой железы паука Latrodectus tredecimguttatus фракционированием его на гидрофильном геле TSK-HW- 55 для отделения низкомолекулярной фракции с Mr 5-10 кДа, дальнейшего разделения полученной фракции на TSK-ДЕАЕ при рН 8 в линейном градиенте концентрации NaCI, последующей очистки её на колонке Ultropac G-2000 при умеренном давлении в 0,5%-ном ацетонитрилфторацетатном буфере с рН 6,5 (схема на фиг. 2), определения ингибирующей активности в полученных фракциях и отбора активной фракции.

Сопоставительный анализ полученного белка-ингибитора АПФ с известными позволяет сделать вывод, что белок,, выделен- ный из яда паука L. tredecimguttatus обладает высокой константой ингибирова- ния, а также отличается приемами и режимами выделения его из яда.

На фиг. 3 показана хроматограмма разделения яда паука Latrodectus tredecimguttatus на TSK-HW-55; на фиг. 4 - хроматограмма разделения активной фракции на TSK-ДЕАЕ; на фиг. 5 - хроматограмма на колонке Ultropac G-2000 при умеренном давлении в 0,5%--ном ацетонитрилфторацетатном буфере, рН 6,5.

П р и м е р 1. а) Приготовление природного сырья.

Цельный яд получают от взрослых самок пауков (5000 особей) препарацией хели- цер и последующей их гомогенизацией при 0-4°С. Гомогенат центрифугируют при 20000 об/мин в течение 30 мин, суперна- тант отделяют и лиофилизируют. Лиофиль- но высушенный яд хранят при 0°С.

б) Выделение активной фракции.

500 мг сухого яда растворяют в 5 мл трис-НС -буфере, рН 8,0, 0,05 М наносят на колонку с гидрофильным гелем TSK-HW-55. Сорбцию проводят в 0,05 М трис-НС -буфере, рН 8,0, элюируя тем же буфером. Получено 6 фракций. Детекцию проводят при длине волны 280 нм (фиг. 3), Каждую из шести фракций исследовали на ингибитор- ную активность. Из фиг. 3 видно, что получе0 но 6 фракций.

Фракции I и II представляют собой высокомолекулярные белки, фракции III и IV- полипептиды с мол. массой 5-10 кДа, фракция III проявляла высокую ингибитор5 ную активность, фракции V и VI - вещества непептидной природы.

Фракцию III собирают и лиофильно высушивают. Выход 150 мг.

Фракцию III подвергают дополнитель0 ной очистке: для этого 150 мг фракции III растворяют в 2 мл трис-НС -буфера, 0,05 М, рН 8,0, и наносят на колонку с TSK-ДЕАЕ, уравновешенной 0,05 М трис-НС -буфером, рН 8,0, в градиенте концентрации NaCI

5 0,05-0,2 М. Скорость элюции 33 мл/ч (фиг. 4). Из фиг. 4 видно, что фракция III делится в этих условиях еще на 3 фракции, Отбирают только фракцию III-2, проявляющую высокую ингибиторную активность. Выход 90 мг. Затем фракцию II1-2 наносят

0 на колонку (7,5x600 мм) Ultropac G-2000 и проводят разделение при умеренном давлении, используя в качестве элюанта 0,5%- ный ацетонитрилфторацетатный буфер. рН 6,5 (фиг. 5). Гомогенность полученного белка

5 иллюстрируется фиг. 5, где показано, что эта фракция элюируется с колонки в виде одного симметричного пика. Выход 40 мг.

Полученный ингибитор АПФ после высушивания представляет собой белое

0 хлопьевидное вещество, хорошо растворимое в воде.

в) Доказательство гомогенности ингибитора АПФ.

Гомогенность ингибитора, выделенного

5 из яда паука Latrodectus tredecimguttatus, доказана электрофорезом в градиенте ПААГ 10-24% с 0,1 % SflS. Мол. масса, определенная этим методом, составляет 10 кДа. Изо- электрическая точка находится в кислой

0 области (Pi 4,7). Аминокислотный состав белка установлен по результатам 24- 48-, 72-часовых гидролизатов.- Ингибитор состоит из 94 аминокислотных остатков с преиму- щественным содержанием гистидина,

5 глутаминовой кислоты, глицина. На N-конце обнаружена глутаминовая кислота. Наличие в структуре сульфидных связей обеспечивает стабильность ингибитора к нагреванию в кислой среде,

г) Определение ингибиторной активности проводят двумя методами.

Флуориметрический метод.

Для этого 0,1 мкг АПФ предварительно инкубируют в 1,9 мл 0,005 М мединалового буфера, рН 7,4, с белком из яда паука в течение 20 мин при 37°С, а затем добавляют 0,1 мл 1 мМ раствора-субстрата (кбз-фен- гис-лей) с последующей флюорометрией. Для этого к пробам (стандартным и исследуемым) добавляют по 0,4 мл 2 М раствора NaOH и 0,1 мл 1 %-ного раствора о-фталево- го диальдегида, Через 6 мин после добавления диальдегида к пробам приливают по 0,2 мл 6 н. раствора HCI. Интенсивность флюоресценции замеряют на флюорометре фирмы Opton.

Ингибирующее действие анализируемого белка на АПФ оценивают по снижению (%) активности фермента соответствующей концентрации ингибитора. Полученные величины наносят на графики и вычисляют величину ICso, которая равна 1x10 7 М. Константа ингибирования (фиг.6)

Методом тонкослойной хроматографии на силикагеле препарат фермента (1.5.Е) предынкубируют при 37°С в 0,1 мл 0,02 М Na-фосфатного буфера, рН 8 содержащего 30 мкг ингиЬитора из яда. в течение 30 мин. Затем прибавляют 0,1 мл раствора БК (30 мкг) в том же буфере и продолжают инкубацию еще 20 мин. Реакцию прекращают под- кислением до рН 2 (0,01 мл 1 н. HCI). В качестве свидетеля ферментативный гид- ролизат брадикинина получают следующим образом: БК(30 мкг) инкубируют 20 мин при 37°С с АПФ (1,5 мЕ) в 0,2 мл 0,02 М Na-фос- фатного буфера, рН 8. Реакцию останавливают 0,01 мл 1 н. HCI до рН 2. Аликвоты гидролизатов наносят на пластинки 10x10 см с тонким слоем силикагеля Kiesilge - 60 (Merok) параллельно с контрольными приборами и пептидами- свиде-: телями. Хроматографию ферментативных гидролизатов проводят в системе растворителей н-бута нол-вод э-пиридин-уксусная кислота (15:12:10:3). Положение пятен на хроматограммах выявляют в УФ-свете после опрыскивания пластин 0,02%-ным раствором флурескомина в ацетоне; Полученные данные (фиг. 7) показывают, что полипептид, выделенный из яда паука Latrodectus tredecimguttatus, ингибирует АПФ, так как в брадикинине не расщепляется связь Про - Фен , которая специфична для АПФ. Это также свидетельствует о том, что полипептид, выделенный из яда паука, полностью ингибирует активность АПФ.

Исследование выделенного белка показывает, что он является новым соединением, проявляющим на порядок выше Ч ингибиторную активность, чем пептид, выделенный из яда змеи.

П р и м е р 2. Аналогичен приме,ру 16, за исключением того, что для фракционирования цельного ядз используют колонку с гель-сефадексом G-50 (фиг. 8).

П р и м е р 3. Аналогичен примеру 16, за исключением того, что фракционирование ведут 0,05 М в трис-НС -буфере, рН 7 (фиг. 9).

П р и м е р 4. Аналогичен примеру 16, за

исключением того, что фракционирование ведут при рН 6,5 (фиг. 10).

П р и м е р 5. Аналогичен примеру 16, за исключением того, что фракционирование зедут при рН 8,5 (фиг. 11).

Как видно из фиг. 8, разделение низкомолекулярных фракций на гель-сефадексе .G-50 происходит недостаточно эффективно. Из фиг. 5-9 видно, что наиболее оптимальное разделение достигается при рН 78.

Таким образом, изобретение дает возможность получить высокоактивный и устойчивый белок-ингибитор АПФ, который, может быть использован в качестве средства для регуляции активности ренин-ангио- тензивной, а также калликреин-кининовой системы в организме.

35

Формула изобретения

Способ выделения ингибитора ангио- тензин-1-превращающего фермента из яда животного происхождения, предусматривающий фракционирование его на хроматографических колонках, отличающийся тем, что, с целью повышения ингибирующей активности, используют яд паука Latrodectus tredecimguttatus, фракционирование проводят на колонке с поперечносшитым декстраном с размером частиц 30-60 и м и разрешающей способностью по белку 1000-600000 в 0,05 трис-HCI буфере, рН 8, отбирают активную фракцию и хрома- тографируют ее на колонке с диэтиламиноэтилсефадексом с размером частиц 44-88 ц м, уравновешенной 0,05 М трис-HCI буфером. рН 8 в градиенте концентрации NaCi 0,05-0.2 М, затем подвергают гель- фильтрации на колонке с гелем Ультропак

G-2000 с размером частиц 10±2 / м и разрешающей способностью по белку 500-6000Г и активную фракцию высушивают.

цельный яд

Использование: биохимия, получение биологически активных веществ. Сущность изобретения: способ получения белка-ингибитора а нгиотензин-1-превращающего фермента заключается в выделении цельного яда из экстракта гомогената ядовитой железы паука Latrodectus tredecimgutlatus, фракционировании его на гидрофильном геле поперечносшитого декстрана для отделения низкомолекулярной фракции с мол. массой 5-10 кДа, дальнейшем разделении полученной фракции на ДЕАЕ-сефадексе при рН 8 в линейном градиенте концентрации NaCI, последующей очистке ее на колонке с гелем Ультропак С-2000 при умеренном давлении в 0,5.%-ном ацетонитрилфтораце- татном буфере с рН 6,5, определении ингибирующей активности в полученных фракциях, отборе активной фракции и ее сушке. Получают белок-ингибитор, содержащий 94 аминокислотных остатка с мол. массой ЮкДа, изоэлектрическойточкой Р0 4,7 с N-концевым остатком - гтгутаминовой кислотой и ICso , равной IxlO M, и константой ингибирования KI, равной М. Высокая активность белка создает предпосылки для использования его в качестве терапевтического средства антигипер- тензивной направленности. 11 ил. СО С

Сефадекс 5-25

7 Ш Ш Ш Ш LL

СП-целлюлоза

дЕЬЕ-сефадем3 стадия

D Ш Ш &

Сеазадекс С- -25

Ш Ш

Ннгибигпор АЛ«й

Цельный я А

Гель-фильтрация на TJK-HW-55F 1-стадия

Ионообменная хроматография на Т5К-ЛЫЈ 2-сгладия

vdL Хроматография на колонке fzff &-ZOOQ SW

LL

1стадия

2стадия

4 стадия

Ьунажная хропатография 5. стадия

Фиг.1

J- стадия

Фиг. 2

.ЖйЩ

/

9L

8800CZ.L

Ж

ff

SI

% JHZU&Jf.GZZHLin

70-8 Ю г Ю . %Р №м

ч

}

i

О -1-- 7

-t-/U С. /

ад

5D ffO

Т

OJ

35

Ю20 30ад5050 -70

Фиг.9Номера пробирок

70 ,, Ш .50

Номера проиирох

Л,

280

л

2801

Ю 20

30 W 50. 60 70

Фиг10 Номера придирок