СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ИЗ ЯДА КОБРЫ Российский патент 2014 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к области ветеринарии и фармацевтической промышленности, в частности к противовирусным средствам на основе эндонуклеаз, и может быть использовано при получении препарата для лечения бешенства коров, вызываемого РНК-содержащим вирусом Neuroryctes rabid, относящимся к группе миксовирусов рода Lyssavirus семейства Rhabdoviridae.

Эндонуклеазы из различных источников являются весьма перспективными противовирусными средствами. Так, панкреатическая эндорибонуклеаза крупного рогатого скота давно используется в медицине при лечении тяжелых форм клещевого энцефалита. Будучи введенной в кровь она настигает в ней и в клетках вирусную РНК и расщепляет ее. Однако оптимум действия панкреатической эндорибонуклеазы лежит в кислой среде и поэтому для того, чтобы она работала эффективно при рН крови и цитозоля клеток (7, 4) приходится вводить ее больному много. Отсюда реакция иммунной системы на чужеродный белок и связанные с этим осложнения. Иное дело содержащаяся в яде кобры относительно неспецифическая низкомолекулярная эндонуклеаза с оптимумом рН 7,8. Она легко проникает через биологические мембраны, обладает большой удельной активностью и действует поэтому в ничтожной концентрации.

Существующий способ выделения эндонуклеазы из яда кобры [1] предполагает добавление на его терминальной стадии альбумина из сыворотки крови человека [2]. Такой препарат идеален для медицины. Однако применение его в ветеринарии для лечения бешенства коров проблематично. Чужеродный белок, внесенный в большом количестве, может вызвать аллергию. Кроме того, использованное в этом способе на терминальной стадии концентрирование в токе воздуха приводит к неоправданным потерям выделяемого фермента.

Цель настоящего изобретения - получить из яда кобры препарат эндонуклеазы не содержащий другого чужеродного для коров белка, и повысить выход целевого фермента.

Поставленная цель достигается заменой на терминальной стадии выделения фермента альбумина из сыворотки крови человека на бычий сывороточный альбумин (БСА), а именно, в раствор эндонуклеазы перед диализом добавляют БСА до конечной концентрации 1,0-2,0 мг/мл, а отдиализованную эндонуклеазу без концентрирования лиофилизуют.

Пример осуществления предлагаемого способа

1. ТЕСТИРОВАНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

Эндонуклеазу тестировали по нарастанию оптической плотности раствора роlу(А) в процессе гидролиза (гиперхромный эффект). Для этого аликвоту раствора фермента инкубировали при 30°С в 3 мл раствора роlу (А) с концентрацией 2,36 ОЕ₂₆₀ / мл в буфере А (0,05 М Трис-HCI, 5 мМ MgCI₂, рН 7,8). Во времени (0-15 мин) регистрировали оптическую плотность реакционной смеси при 260 нм в термостатируемой прямоугольной кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре "Specord М 40". Контроль - 3 мл раствора роlу(А) с концентрацией 2,36 ОЕ₂₆₀ / мл в буфере А. По начальному линейному участку полученной кинетической кривой рассчитывали скорость реакции. За единицу активности эндонуклеазы принимали такое количество фермента, которое в данных условиях вызывало нарастание оптической плотности при 260 нм со скоростью 1 ОЕ/мин.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

Выделение фермента проводили при 0-4°С. 3 г яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxiand) растворяли в 40 мл буфера Б (0,05 М Трис-сукцинат, рН 5,6). В растворе яда определяли содержание белка, как описано в работе [1], и активность эндонуклеазы (аликвоты 2,5; 5 и 10 мкл, разбавленной в 30 раз буфером Б - пробы фермента).

2.1. Гель-фильтрация раствора яда кобры на сефадексе G-75. Колонку К 50/100 фирмы «Pharmacia» (Швеция), заполненную на 89 см сефадексом G-75 (сверхмелким), наслоенным на 1 см «подушку» из сефадекса G-75 с диаметром гранул 40-120 мкм, уравновешивали буфером Б, наносили на нее 41,2 мл раствора яда и элюировали буфером Б со скоростью 19,4 мл/ч. Фракции объемом 9,7 мл собирали на коллекторе, измеряли в них оптическую плотность при 280 нм и активность эндонуклеазы (аликвоты по 2 мкл, время реакции 5 мин).

Фракции 82-95, содержащие эндонуклеазу, объединяли (объем 135,8 мл) и определяли в них содержание белка и активность фермента (аликвоты 2,5;5 и 10 мкл разбавленной в 10 раз буфером Б пробы фермента).

Фракции 47-54 (первый пик), содержащие элюирующиеся совместно фосфодиэстеразу и 5' - нуклеотидазу, объединяли (объем 77,6 мл) и диализовали в течение 2 сут против 2 порций по 1 л буфера В (0,02 М Трис-HCl, рН 8,9), после чего концентрировали в течение 1 сут диализом против 250 мл 50% раствора глицерина в буфере В. Сконцентрированный препарат двухферментного биокатализатора (объем 16,6 мл) хранили при -20°С.

Хвостовые фракции, содержащие фосфолипазы, и небольшой последний пик токсинов замораживали и хранили при -20°С.

2.2. Хроматография эндонуклеазы на SP-сефадексе С-25. 135,8 мл раствора эндонуклеазы, полученного на стадии гель-фильтрации, наносили на колонку (1,4×33 см) с SP-сефадексом С-25, уравновешенную буфером Б. Колонку промывали 100 мл буфера Б и фермент элюировали далее линейным градиентом концентрации NaCl при возрастающем рН: смеситель - 350 мл буфера Б; резервуар - 350 мл 0,4 М NaCl в 0,05 М Трис, рН 10,16. Скорость элюции 24 мл/ч. Фракции объемом 8 мл собирали на коллекторе и измеряли в них оптическую плотность при 280 нм и активность эндонуклеазы (аликвоты по 2 мкл, время реакции 5 мин). Фракции 48-59, содержащие эндонуклеазу, объединяли (объем 96 мл) и определяли в них содержание белка и активность фермента (аликвоты 5, 10, и 20 мкл разбавленной в 10 раз буфером Б пробы фермента).

2.3. Диализ и лиофилизация эндонуклеазы. К 96 мл раствора эндонуклеазы, полученного на стадии хроматографии, добавляли 144 мг БСА, раствор переносили в целлофановый мешок и диализовали в течение 2 сут против 2 порций по 1 л буфера Г (0,02 М Трис-HCl, рН 7,8). В отдиализованном препарате фермента (объем 105 мл) определяли активность эндонуклеазы (аликвоты 5, 10, и 20 мкл, разбавленной в 10 раз буфером Г пробы фермента).

Отдиализованную эндонуклеазу, стабилизированную БСА, пропускали через стерилизующие мембраны и лиофилизовали порциями по 0,2 мл. Лиофилизованный препарат эндонуклеазы с БСА хранили в герметично закрытых резиновыми пробками и завальцованными алюминиевыми колпачками флаконах при 4-10°С без потери активности, по крайней мере, в течение 2 лет.

Способ обеспечивает увеличение выхода эндонуклеазы при выделении по сравнению с прототипом [1] на 25% за счет исключения достаточно жесткой стадии концентрирования в токе воздуха, а также устраняет препятствие на пути ее использования для лечения бешенства коров.

Источники информации

1. Комарова Н.И., Медяникова Л.В., Троцкий Н.Ф., Яцухина И.Я., Ямковой В.И. Выделение нуклеаз из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana. II Биотехнология. 1992. №3. С.35-38.

2. Патент СССР №1721087.

Изобретение относится к области биохимии и представляет собой способ выделения эндонуклеазы из яда кобры. Сначала проводят гель-фильтрацию раствора яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxiana) на сверхмелком сефадексе G-75, затем хроматографию эндонуклеазы на SP-сефадексе C-25, диализ выделенного фермента с добавлением балластного белка, стерилизацию и лиофилизацию. При этом перед диализом добавляют БСА до конечной концентрации 1,0-2,0 мг/мл, а отдиализованную эндонуклеазу без концентрирования стерилизуют и лиофилизуют. Способ позволяет увеличить выход эндонуклеазы при выделении, а также устранить препятствие на пути ее использования для лечения бешенства коров. 2 пр.

Способ выделения эндонуклеазы из яда кобры, включающий гель-фильтрацию раствора яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxiana) на сверхмелком сефадексе G-75, хроматографию эндонуклеазы на SP-сефадексе С-25, диализ выделенного фермента с добавлением балластного белка, стерилизацию и лиофилизацию, отличающийся тем, что, с целью снижения потерь эндонуклеазы на терминальной стадии выделения и адаптации получаемого препарата к лечению бешенства коров, в раствор фермента перед диализом добавляют бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 1,0-2,0 мг/мл, а отдиализованную эндонуклеазу без концентрирования стерилизуют и лиофилизуют.