Способ получения (+) салютаридина Советский патент 1976 года по МПК A61K31/07 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ( + ) САЛЮТАРИДИНА

неорганические соли, включающие микровключеиия металлов, необходимых для соответствующей жизнедеятельности (метаболизма, обмена веществ) микроорганизмов.

В основном углеводы типа Сахаров, например декстроза, сахароза, мальтоза, лактоза, декстрин и т. п., и крахмалы служат подходящими источниками ассимилируемого (усвояемого) углерода в питательных средах. Количество углевода колеблется в пределах 0,1- 6% от веса среды. Эти углеродные источники применяют по отдельности, либо несколько таких углеродных источников соединяют в среде.

Различные азотные источники, такие, как казеиновые гидролизаты, кащевидные выварки из муки соевых бобов, муки арахиса, муки жмыха земляного ореха, фильтрат барды, кукурузные соки и т. п., легко усваиваются микроорганизмами.

Получаемый в результате процесса () салютаридин легко извлекают путем экстрагирования щелочной фильтрованной жидкости посредством подходящего водного несмешивающегося растворителя, например этилацетатом или бензолом. Затем раствор очищают очередной экстракцией, разделением диффузией через перегородки между щелочными водными растворами продуктов ферментации и водными несмешивающимися растворителями или с помощью средств хроматографии жидкостей или тонкопленочной хроматографии на двуокиси кремния и т. н.

Окислительные фенолсвязующие ферменты превращают (-) ретикулин в ( + ) салютаридин и продуцируются видами микроорганизмов Schizomycetes и Eumycetes.

Культуры этих организмов хранятся в коллекции культур Позерн Риджэнэн Рисарч Лэбраториа Министерства (Департамента) сельского хозяйства - института, расположенного в Пеории штат Иллинойз, и где значатся под номерами NRRL Pseudomonas SP MB 3119 -NRRL 5686 Streptomyces sp MA 4382 - NRRL 5688 Streptomyces sp MA 4383 - NRRL 5689 Streptomyces sp MA 4384 - NRRL 5690 Streptomyces sp MA 4390 - NRRL 5691 Streptomyces griseus MA-8 -NRRL 5687

Другие микроорганизмы, которые необходимы для процесса, предлагаемого изобретением, подпадают под класс Eumycetes, а именно подклассы Phycomycetes и Fungi imperfect класса Eumycetes, включают разновидности родов Mucor, Cunninghamella, Syncephalastrum, S. Neurospora и Parasitella подклассов Mucorales и Sphoeriales, a также родов Penicillium Aspergillus, Torula и Sterigmatocystis подкласса Fungi imperfecti.

Следующие культуры были навечно помещены в Коллекцию культур Департамента сельского хозяйства США - Позери Риджинал Ресорч Лабораториа, г. Пеория, штат Иллинойз,

они зарегистрированы под следующими номерами NRRL:

Cunninghamella sp. MF 4547 - NRRL 5695 Aspergillus sp. MF 4536 - NRRL 5694 Torula cremoris MY-59 - NRRL 47495 Neurospora sp. MF-2347 -NRRL 5692 Penicillium chrysogenum MF 3965 - NRRL 5693

Пример 1. Одну лиофилизированную пробирку культуры микроорганизмов Parasitella simplex АТСС 6476 суспендируют в 10 мл стерильной основной среды. 0,3 мл полученной суспензии используют для засева каждых 10 мл стерилизованной основной среды, содержащей ЗХЮ г ретикулина, в тестпробирках размером 25X150 мм. Эти пробирки с полученным препаратом инкубируют при 28°С в течение 5 дней на аппарате, обеспечивающем вращательно-встряхивающее движение. Затем эти пробирки снимают со встряхивателя и добавляют 1 мл 0,5 М динатрийфосфата, отрегулированного до значения 8с помощью NaH2P04, после чего добавляют 2 мл этилацетата. Эту смесь подвергают энергичному встряхиванию до получения высокодисперсной (ровной) эмульсии. Затем эту эмульсию переносят в специальную пробирку для центрифугирования и подвергают центрифугированию на протяжении достаточного промежутка времени, чтобы расслоить эмульсию на фракции растворителя и водную. Затем полученный экстракт этилацетата подвергают анализу посредством жидкостной хроматографии и тонкопленочной хроматографии, тем самым показывая наличие салютаридина.

Основную среду препарировали путем растворения, г: декстрозы - 10; солодовой вытяжки - 3; дрожжевого экстракта - 2, питательного бульона (Difco) - 8 в достаточном количестве воды, с тем, чтобы обеспечить 1 л среды. Перед тем, как ее использовать, регулируют рН этой среды до значения 7,0 за счет добавления гидроокиси натрия. При использовании в качестве твердой (питательной) или поддерживающей среды в ее состав включают агар в количестве 20 г/л. Стерилизацию производят путем автоклавирования сред в течение 20 мин при 121°С.

Ретикулин добавляют асептически как стерильный водный раствор. Этот раствор препарировали путем растворения 6 мг в 1 мл воды, регулируя при этом значение рН до 7 и осуществляя стерилизацию посредством фильтрации.

Препарированный этилацетатовый экстракт подвергают (пробирному) количественному анализу на наличие салютаридина с помощью средств жидкостной хроматографии на анионообменной смоле или силикагеле.

Ферментационные бульоны, дающие полол ительные резз льтаты в общей классификации (сортировании, отборе) посредством жидкостной хроматографии, перепроверяются с помощью двух различных систем тонкослойной хроматографии. Для этой цели оставшуюся половину этилацетатного экстракта данного бульона разделяют и наносят на пластины для тонкослойной хроматографии в двух местах (точках) на каждой из двух пластин. Одна из этих точек суть присадка (или смесь, примесь) с подлинным ( + ) салютаридином, которая позволяет производить наблюдение совпадения с точкой полученного вещества и фигурирует как еще одно доказательство помимо значения Rf. Чистый образец (пробу) (-f-) салютаридина также наносят вдоль двух выщеуказанных мест на пластине. Проработанные пластины визуально наблюдаются посредством ультрафиолетового поглощения (гашение свечения пластин, подверженных воздействию ультрафиолетового излучения) и посредством цветовой реакции, вызванной парами Ь.

( + ) Салютаридин покидает область возникновения (R/ 0,3) и при воздействии Ь - паров он приобретает характерный серый цвет, который вскоре превращается в желтый.

Пример 2. Суспензию Parasitella simplex АТСС 6476, препарированную аналогично примеру 1, используют для посева через стерильную петлю на поверхность скошенного агара, содержащего основную среду. Затем эти скосы инкубируют в течение 5 дней ири 28°С, наблюдая при этом великолепный рост культуры. Несколько полных петель такого гриба из инкубированного скоса используют для посева в 40 мл стерильной основной среды. 1 мл полученной суспензии используют для посева в каждую из тридцати колб Эрлеимейера емкостью 250 мл, содержащих 40 мл стерильной основной среды, плюс 300 мкг/мл (-) ретикулина. Полученные таким образом инокулированные колбы, а также контрольные колбы (без ретикулина) инкубируют ири 28°С в течение 6 дней на ротационном встряхивателе. В это время были сгруппированы (собраны) колбы, содержащие ретикулин, после чего проводят количественный анализ на салютаридин как для ферментационного бульона, содержащего ретикулин, так и для контрольного бульона. Контрольные бульоны не содержали салютаридина, тогда как бульоны, содержан ие ретикулин, имели в своем составе салютаридин.

Пример 3. Скошенную культуру Parasitella simplex АТСС 6476, описание которой имеется в примере 2, применяют для инокулирования 40 мл основной среды в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, после чего систему инкубируют на протяжении 2 дней (2 сут) на встряхивателе ири 28°С. 1 мл полученной посевной (семенной) культуры используют для инокулирования каждой из 60 колб, содержащей 40 мл основной среды с 300 мкг/мл ретикулина. После проведения инкубации при 28°С в течение 5 сут па встряхивателе полученные ферментационные бульоны подвергают количественному .анализу.

В резлльтате анализа в бульоне содержится салютаридин.

Пример 4. Одну нолную петлю Parasitella simplex АТСС 6476 переносят со скошенной культуры 10 мл стерильной основной среды. 0,25 мл полученной суспензии используют для инокуляции тест-пробирок (размер 25Х 150 мм), содержащих 10 мл стерильной основной среды и 300 мкг/мл ретикулииа. Эти

инокулированные пробирки инкубируют при 28°С на ротационном встряхивателе. Отдельные пробирки выводят из эксперимента через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней инкубации и подвертают количественному анализу на наличие

салютаридина. Ниже приведены количественные данные салютаридина, содержащегося в ферментационных бульонах:

Время инкубации. Образовавшееся колисутчество салютаридина,

10-S г/мл

0,5 0,9

5 6 7 8 9 10 3,6

1,4 3,5 2,9 5,7

П р и м е р 5. Бульон, полученный путем ферментирования 2250 мл основной среды, содержащей 675 мг ретикулина (как описано в примере 3) делают щелочнылт, доведя значение рН до 8,1 за счет добавления 14,2 г динатрия фосфата. Полученную смесь перемешивают с 500 мл этилацетата и профильтровывают. Водный слой фильтрата экстрагируют двумя порциями этилацетата по 350 мл и цолучент ые комбинированные экстракты высушивают на натриевом сульфате и подвергают -концентрации в ваклуме. Полученный в результате остаток (осадок) разделяют между 100 мл 4%-ного раствора гидроокиси натрия и 100 мл бензола под азотом. Отделенный водный слой промывают дополнительной дозой бензола и затем окисляют до значения рН 7,0-8,0 с помошью 85%-ной фосфорной кислоты. Полученный щелочной раствор в азотной атмосфере экстрагируют хлороформом, после чего комбинированные экстракты высушивают и концентрируют. Остаток .цодвергают исследованию посредством методов хроматографии на трех пластинах двуокиси кремния с использованием 20%-ного метанола в хлороформе в качестве нроявляющего растворителя. Посредством ультрафиолетовых лучей на проявленных пластинах обнаруживают две большие полосы и отделяют соскабливанием. Соскобленный материал, в котором имеется двуокись кремния, перешедшая из основания - пластинки, экстрагируют метанолом, затем испаряя метанол получают твердый осадок из его паров, который вновь экстрагируют дихлорметаном, что приводит

к получению материалов, свободных от содержания двуокиси кремния. Более медленно движущаяся полоса (R/ 0,6; 13,0 мг) была идентифицирована как изосалютаридин. Продукт быстрее движущейся полосы (,B5) требовал дальнейшей очистки, которая выполнена на окисноалюминиевых (двух) пластинах с использованием хлороформа в качестве растворителя (,5). Выделение (извлечение) продукта из полосы позволяет получить 13,4 мг салютаридина в виде желтого кристаллического твердого вещества. Кристаллизация от 0,2 мл этилацетата дала 7,1 мг бледно-желтых кристаллов. Т. пл. 212-214°С; -fl4,7-f7,8 (С 0,48, NaOH); Я NaOH 280 нм (), 241 нм (2 18900): ядерный магнитный резонанс макс. (С DCls) т 2,66 (Cs-Н), 3,47 (АБ квартет, Ci-Н и Cs-Н) 3,83 (Cs-Н), 6,21 и 6,34 (ОСНз) и 7,61 частей на миллион (NCHs), накладываемые с подлинным (образцом, пробой) ( + ) салютаридина.

Масс-спектрограмма: М 327, м/о 312, 299, 284.

Для изосалютаридина (CDCls) т 3,37 (€5- Н), 3,46 (С4-Н), 3,80 (С,-Н), 3,83 (Сз-Н), 6,19 и 6,28 (ОСНз) и 7,59 частей на .миллион (N-СНз) все синглеты.

Пример 6. 1 л стерилизованной основной среды, содержащей декстрозу, солодовую вытяжку, дрожжевой экстракт и питательный бульон (Difco), а также 400 мг (-) ретикулина НС1-21 20 эквивалент 339 мг (-) ретикулиновой основы инокулируют культурой Parasitella simplex АТСС 6476 и инкубируют посредством аэрации в течение 6 дней при 28°С. К полученной в результате аэрации ферментационной жидкости (бульон) добавляют 100 мл 0,5 М двунатриевого фосфата и 250мл бензола. После тщательного перемешивания смесь профильтровывают, органический слой отделяют, а водную фазу экстрагируют дополнительным количеством в 250 мл бензола. Комбинированные бензоловые экстракты высушивают над натриевым сульфатом и экстрагируют двумя порциями по 50 мл 1 Н. раствора гидроокиси натрия в атмосфере азота. Комбинированные щелочные экстракты подвергают обратной промывке бензолом, окисляют до значения рН 7,5 с помощью 85%-ной фосфорной кислоты и дважды экстрагируют посредством 200 мл бензола. Комбинированные бензольные экстракты сушат над сульфатом натрия и концентрируют до состояния полного высыхания в вакууме с целью получения остатка неочищенного (-Ь) салютаридина. Этот остаток исследуют средствами хроматографии с выходом фракции ( + ) салютаридина, позволяющей кристаллам от этилацетата плавиться при 191 - 194°С (т. пл. подлинного ( + ) салютаридина 190- 194°С).

Пример 7. Большое количество идентичных пробирок, содержащих стерилизованную основную среду и 300 мкг (-) ретикулина/мл, инокулируют культурой Parasitella simplex

АТСС 6476 и инкубируют при тех же зсловиях, которые указаны в примере 1. Спустя 3 дня после инокуляции выводят пробиркидубликаты, определяют значение рН и проводят количественный анализ бульона. Ниже приведены количественные данные салютаридина, содержащегося в ферментационном бульоне.

Срок выдержки, Значение рН Количество

сутбульонасалютаридина,

мкг/мл

37,20,1

47,61,1 5 8,0 2,8

68,01,1

78,13,9

88,33,4

98,55,6 108,75,1 П8,84,4 128,84,7

Пример 8. В сушильную чашу поместили 500 мл стандартной основной среды, содержащей 300 мкг/мл ретикулина. Поверхность этой среды инокулируют путем спринцевания споровой суспензией Parasitella simplex АТСС

6476 и инкубируют при 28°С на протяжении 5 дней. За это время плотную насыщенную и массивную пленку, которая выросла на поверхности, снимают и переносят из первоначальной чашки в другую, содержащую только 500 мл 0,1 Н, ацетатного буферного раствора (рН 5,0). Эта пленка плавает в течение 1 ч на поверхности буферного раствора, слегка покачиваясь и затем ее снова переносят в чашу, содержащую точно такой же буферный раствор плюс 0,1% декстрозы и 300 мкг/мл ретикулина (ЗХЮ г/Ю- л или 0,3 г на 1 л). Затем эту чашку инкубируют при 28°С в течение еще 6 сут. Получают результаты количественного анализа на среде первоначального роста в течение 5 дней и на заключительной среде покоящихся клеток за 6 дней. Первоначальная питательная среда содержала 1,3 мкг/мл ( + ) салютаридина в момент переноса, а среда покоящихся клеток -

2,13 мкг/мл по истечении 6 дополнительных дней. В фазе покоящихся клеток не отмечалось заметного дополнительного роста микроорганизмов. Пример 9. Различные стерилизованные

среды, содержащие 300 мкг/мл (-) ретикулина инокулируют микроорганизмами Parasitella simplex АТСС 6476, и в течение 4 дней наблюдают их рост, после чего производят количественный анализ на содержание салютаридина.

Ф о р М )Ч1 а изобретения

Способ получения ( + ) салютаридина путем окисления ретикулина, отличающийс я тем, что, с целью повышения выхода це9левого продукта, окисление ферментативным путем с осуществляется культур микроорганизмов классов Schizomyиспользованием cetes или Eumycetes. 507204 10