СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-р/В-5-АМИНО-5- Советский патент 1974 года по МПК C12D9/14 

.щ :. , i,nv::i,ii iiJ КАРБОКСИВАЛЕРАМИДО /-3-/ КАРБАМОИЛОКСИМЕТИЛ/ /-7-МЕТОКСИ-3-ЦЕФЕМ-4-КАРБОПОВОЙ КИСЛОТЫ (ЦЕФАМИЦИНА С)

ской. Воздушный мицелий редкий, кремоватый. Растворимый пигмент отсутствует.

Столбик желатины. Вегетативный мицелий редкий кремовый с оранжевым оттенком, распределенный по всему столбику агара.

Лакмусовое молоко. Вегетативный мицелий рыжевато-коричневый, редкий, кольцеобразный. Воздушный мицелий отсутствует. Пептонизация: щелочная реакция рН 7,8- 7,4 (контрольный рН 6,7).

Пример 1. Лиофилизированной культурой Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 инокулируют колбы Эрленмейера, содержащие по 50 мл питательной среды следующего состава, г:

Дрожжевой автолизат10,0

Глюкоза10,0

Фосфатный буфер2,0 мл

MgSO4-7:H2O0,05

Дистиллированная

вода1000 мл

рН среды6,5

Состав фосфатного буфера, г:

КН2РО491,0

Na2HPO495,0

Дистиллированная

вода1000

Инкубируют в течение трех дней при 28°С на роторной качалке, имеющей 220 об/мин и размах 508 мм. Затем содержимое колб стерильными пипетками переносят в четыре колбы такого же размера, содержащие вышеуказанную среду, после чего эти колбы встряхивают на качалке описанным выше способом. Содержимое этих четырех колб затем аккуратно сливают в одну колбу и используют для инокулирования И двухлитровых колб Эрленмейера, в каждой из которых содержится по 350 мл среды следующего состава, г:

Дрожжи янтарные

тип 30010

Барда20

Декстроза10

Дистиллированная вода 1000 мл Затем колбы встряхивают в течение 4 дней при 28°С на роторной качалке, имеющей 145 об/мин и размах 50,8 мм. В конце инкубационного периода содержимое 10 таких колб объединяют и полученную пробу центрифугируют для отделения мицелия.

Присутствие в культуральной жидкости антибиотика, т. е. 7-|р-/В-5-амино-5-карбоксивалерамидо/-3-/карбамоилоксиметил/ - 7 - метокси-З-цефем-4-карбоновой кислоты определяют агар-диффузионным методом, используя бумажные фильтровальные диски диаметром 12,7 мм. Диски окунают в культуральную жидкость и помещают на поверхность чашек Петри, в которых находится 10 мл питательного агара (Difco) и 0,2%-ный дрожжевой экстракт (Difco) с посеянным бактериальным инокулумом. После инкубации в течение ночи при 28°С измеряют в миллиметрах диаметры защитных зон.

.Проведенные биоиспытания на чашках, засеянных Vibrio percolons (MB-1272) показали, что после 4-дневной ферментации образуются защитные зоны диаметром 31,5 мм. Отфильтрованную культуральную жидкость подкисляют до рН 7 разбавленной соляной кислотой и 290 мл адсорбируют на 100 мл сильиоосновной анионообменной смолы, имеющей стиролдивинилбензольную матрицу, при расходе 10 мл в 1 мин. Отработанный раствор собирают фракциями но 500 мл. Смолу промывают водой и элюируют 3%ным раствором хлористого аммиака в 90%ном метаноле. Элюат собирают фракциями

но 100 мл. Все фракции подвергают биоиспытаниям против Vibrio percolons (МВ1272).

Проведенные опыты показали 60%-ную активность в отработанной фракции и 18%ную активность во фракции алюата. Кроме того, в этих опытах было установлено, что смола адсорбирует только две фракции или 10 объемов бульона. Элюированные фракции 1-4 объединяют и концентрируют, удаляя метанол. Отработанные фракции 3-6 объединяют, получая I960 мл раствора, подщелачивают разбавленной гидроокисью натрия, доводя рН от 7,2 до 8, и адсобируют на 100 мл сильноосновной анио.нообменной смолы, имеющей стиролдивинилбензольную матрицу при расходе 14 мл в 1 мин. Отработанный раствор собирают в четыре равные фракции и проводят биоиспытания. iB результате испытаний установлено, что

активность этих фракций составляет 5%.

Колонку промывают водой и элюируют 5%-ным водным раствором хлорида натрия. Элюат собирают фракциями но 50 мл и подвергают биоиспытаниям.

Биоиспытания показали, что в объединенных фракциях 3-Ii6 активность составляет 90%.

50 мл полученного концентрата разбавляют до 500 мл, меняя рН от 8,8 до 2 с по

мощью разбавленной соляной кислоты, и адсорбируют на 25 мл сильнокислой обменной смолы сульфонатного типа, имеющей стиролдивинилбензольную матрицу (смола Дауэкс 50X2, водородный цикл), при расходе 2,5 мл в 1 мин. Колонку промывают 25 мл воды и затем элюируют 2%-ным пиридином до тех пор, пока рН эфлюента не поднимется до 7 (54 мл).

Биоиспытания отработанных фракций

элюата показали, что отработанные фракции имеют 9%-ную активность, а элюат 90%ную активность. Элюат классифицируют, как пиридиновую соль антибиотика. .Полученный продукт является амфотерным, имеющим изоэлектрическую точку при рН около 3,5. Продукт не устойчив при рН выше 7 и устойчив при рН 1,5.

Полученный элюат подщелачивают до рН 8 разбавленной гидроокисью натрия и концентрируют в вакууме, отделяя пиридин.

Полученный этим способом продукт классифицируют, как моионатриевую соль антибиотика.

Молекулярный вес на основании эмпирической формулы равен 468.

Найдено, %: С 39,31; Н 4,76; N 11,16; S 6,46; О 34,12; Na 4,19.

Ci6H2iN4SO9

Вычислено, %: С 41,0; Н 4,5; N 12,0; S 6,8; О 30,8; Na 4,9.

.При испытаниях полученного антибиотика было установлено, что он обладает защитными свойствами против следующих грамотрицательных бактерий: Esherichia coli, Proteus vulgaris, Alcaligenes faccalis, Brucella bronchiseptica. Salmonella gallinarum. Vibrio percolans и Xanthomonos vesicatoria, a также против следующих грам-положительных бактерий: Staphylococcus acereus, Sarcina lutea и Bacillus subtilis

Пример 2. Выращивание культуры проводят как в примере 1, используя на последнем этане среду следующего состава, г: Staleys 4S соевой муки 30,0 Перегнанные растворители 7,5 Церелоза20,0

NaCl2,5

СаСОз (рН 7,0)10,0

Дистиллированная вода 1000мл Присутствие антибиотика обнаружено через агар-диффузионное определение, осуществленное на дисках из фильтровальной бумаги 12,7 мм. После инкубации в течение четырех дней, проба бульона дает зону ингибирования 0,33 мм против Vibrio percolans (MB-1272).

Пример 3. Лиофилизированной культурой Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 инокулируют 50 мл стерильной среды следующего состава, г:

Дрожжи10,0

Глюкоза10,0

Фосфатный буфер2,0

MgS04-7H2O0,05

Дистиллированная

вода1000 мл

рН доводится до 6,5 с применением NaOH Состав фосфатного буфера, г:

КН2Р0491,0

Na2nPO495,0

Дистиллированная вода 1000 мл

Инкубируют при 28°С в течение 72 ч при встряхивании. 10 мл полученной культуральной жидкости инокулируют колбы Эрленмейера, содержащие 50 мл стерильной среды, описанной выще, и инкубируют в течение 48 ч при 28°С. Затем содержимым колбы инокулируют ферментатор из нержавеющей стали емкостью 189,25 л, содержащий 160 л среды, описанной выще. Инокулированная среда затем инкубируется при 28°С в течение 48 ч при неремещивании при постоянной аэрации. В течение процесса ферментации прибавляют небольщие количества полигликоля для контролирования вспенивания. 43л инокулянта, полученного в результате выращивания, применяют для инокулирования ферментатора из нержавеющей стали емкостью 757 л, содержащего 467 л стерильной среды следующего состава, г:

Янтарные дрожжи 30010,0

Перегнанные

растворители20,0

Дистиллированная

вода1000 мл

рН 7,0.

Инкубируют при температуре 28°С при

аэрации в течение 72 ч.

В процессе ферментации прибавляют небольшие количества противовспенивающего агента, например полигликоля 2000, для предотвращения интенсивного вспенивания.

Отбирают партию и определяют активность при помощи пробы на дисковой пластине. Бульон от ферментации профильтровывают через диатомитовую землю при рИ 7,8 и полученный этим способом продукт идентифицируют как цефамицин С.

Определение на дисковой пластине при

разбавлении 1 : 10 дает зону ингибирования

21,5 мм против Vibrio percolons (MB-1272).

Пример 4. Четыре ферментативные пар.тии, полученные согласно примеру 1, адсорбируют на 100 мл сильноосновной анионообменной смоле, содержащей стиролдивинилбензольную матрицу (Дауэкс 1X2 хлоридную циклическую смолу) и элюируют 1%ным водным раствором хлористого натрия. Этот элюат собирают по фракциям 50 мл и испытывают. Элюированные фракции из всех четырех партий - доводят до рП 5 при помощи разбавленной соляной кислоты

и объединяют, получая 4300 мл раствора. 4200 мл этого раствора перемешивают с 42 г угля (Дарко С-60) в течение 30 мин. Затем уголь отфильтровывают и промывают водой. Фильтрат и промывные воды не имеют активности. Угольную массу промывают порцией по 1 л 60%-ным водным ацетоном при перемещивании смеси в течение 30 мин и каждый раз отфильтровывают. Полученные элюаты концентрируют

в вакууме до 108 мл и 100 мл соответственно. Пробы показали, что первый элюат содержит 76% активности, т. е. в 18 раз активнее исходного вещества, а вторая фракция содержит 17% активного вещества, т. е.

в 14 раз активнее исходного вещества.

Эти два концентрата объединяют и концентрируют до 61 мл и доводят до рН 4-5 при помощи разбавленной гидроокиси натрия. Этот концентрат содержит 40 мг/мл сухого

твердого вещества и дает 25 мм зону против MB-127,2 при разбавлении 1 : 100 (400 мкг/мл). Этот продукт идентифицирован, как мононатриевая соль .7-|р-/0-5-амино-5-карбоксивалерамидо/-3-/карбамоилоксиметил/-7- метоксиЗ-цефем-4-карбоновая кислота.

Предмет изобретения

1. Способ получения 7л|3/О-5-амино-5-карбоксивалерамидо/-3-/карбамоилоксиметил/ - 7метокси-З-цефем-4-карбоновой кислоты (цефамицина С), отличающийся тем, что культуру Streptomyces lactamolurans NRRL 3802 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и мииеральиые соли, при 20-37°С и рН

среды 6,0-8,0 в течение 2-4 дней с последующим выделением целевого продукта.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют углероды, и их концентрация в среде составляет 1-6 вес. %.

3.Способ по пп. 1и2, отличающийся тем, что содержание источника азота в среде составляет 0,2-6 вес. %.