"Способ получения агликона антибиотческого а-35512 фактора в4 Советский патент 1981 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к .получению антибиотиков путем культивирования микроорганизмов и выделения целевого продукта из культуральной жидкоети. Точнее, способ касается получени агликонового фактора смеси антибиотиков А-35512, образуемых микроорганизмами вида Streptomyces candidus MRRL 8156. Известны антибиотики А-35512, которые обладают свойствами, аналогичными свойствам гликопептидных соединений. Эти в.ещества достаточно хорош изучены. Выделены различные фракции с антибиотической активностью. Известны, например, ристомипины, ристо цетины. Для получения указанных антибиотиков используют различные способы - экстракция, хроматография, гидролиз fll и 2J , Однако известные антибиотические вещества и способы их получения не касаются лечения кариеса зубов и угрей. Цель изобретения - получение агли кона А-35512. Поставленная цель достигается тем что фактор-В гидролизуют 0,05-1,5 нормальной органической или минеральной кислотой в течение. 0,5-12 ч. Агликбн фактора А-35512 В получают путем ферментации в аэробных условиях культуры Streptomyces cand.idus NRRL 8156. 5икpoopгaнизмы выращивают на среде с источником углеводов, азота, минеральных солей до получения достаточной антибиотической активности. Смесь А-35512,содержащую факторы А, В, С, F, G .Н, отделяют от среды для культивирования. .Далее извлекают фактор В и из него Путем кислотного гидролиза выделяют агликон. Дигидрохлорид А-35512 фактора В имеет, по крайней мере, одну гидроксильную группу, способную участвовать в эфиризации. Дигидрохлорид А-35512 фактора В растворяется в воде, частично растворяется в спиртах, таких, как метанол и э.танол, и нерастворим в других менее органических растворителях, таких как бензол, хлороформ, ацетон, диэтиловый эфир, этилацетат, толуол, гексан, ацетонитрил и диоксан. Дигидрохлорид А-35512 фактора В стабилен в течение 72 ч в водных растворах, имеющих рН в области от 3 до 10.

Гидрохлорид А-35512 фактор В агликона является белым аморфным соединением, имеющим следующий состав, %: углерод 54,29; водород 4,34; азот 7,40; хлор 5,02; кислород 28,95.

Инфракрасный спектр поглощения гидрохлорида А-35512 фактор В агликона в.пасте Нуйола имеет наиболее значительные пики поглощения на следующих частотах , 3440 (изгиб), 3340 (изгиб), 3215 (интенсивный), 2950 (изгиб), 2910 (интенсивный), 2840 (интенсивный),2640 (изгиб), 1735.(слабый), 1655 (интенсивный), 1590 (умеренный), 1500 (интенсивный), 1460 (интенсивный), 1378 (умеренный) ,. 1365 (изгиб), 1298 (умеренный), 1215 (умеренный), 1155(умеренный), 1120 (изгиб), 1105 (слабый), 1060 (слабый),1040 (слабый), 1008 (умеренный), 925 (слабый), 875 (слабый), 765 (изгиб) и 718 (слабый).

Электрометрическое титрование гидрохлорида А-35512 фактор В агликона в 66%-ном водном растворе диметилформамида указывает на присутствие трех титруемых групп с значениями рКд, равными- 7,5; 9,25 и 11,0, и на возможное присутствие двух дополнительных групп со значениями рН большими чем 11,0.

Гидрохлорид А-35512 фактор В агдикона имеет мол. вес около 1282, что установлено при помощи титрования.

. Гидрохлорид А-35512 фактор В агли кона имеет следующие характерные вращения: ci|,- 178 (С 5, ) ; ot 365-716,8 vC 5, СН,ОН) .

Ультрафиолетовый спектр поглощени агликона имеет в кислом .и нейтральном метаноле максимум поглощения в 282 нм (Е;/( 102,62) , а в щелочном метаноле - максимум поглощения в 302 нм (E:,c 182,09) .

А С спектр ядерного магнитного резонанса А-35512 фактор В агликона в DMSO-dg при 90°С имеет следующие характеристики:

№ РРМ . Высота, %

А с спектр ЯМР указывает на то,

что А-35512 фактор Вагликон продолжает удерживать составляющие 3-амино 2,3,6-тридиокси-3-е-метил-1-ксилЬгексапиранозу (один из Сахаров, содержащихся в А-35512 факторе В).

Амино-кислотный ансьлиз гидрохлорида А-35512 фактор В агликона, noj вергнутого дальнейшему гидролизу в кислоте, указывает на то,, что А-3551 фактор В агликон содержит глицин и, по крайней мере, три составных амино кислотных остатка. Гидрохлорид А-35512 фактор В агли кона имеет., по крайней мере, одну гидроксильную группу, способную учас вовать в процессе этерификации. Гидрохлорид А-35512 фактор В агли кона растворим в воде и метаноле, но не растворим в менее полярных органи ческих растворителях, таких как бензол, хлороформ, ацетон, диэтиловый эфир, этилацетат, толуол, гексан, ацетонитрил и диоксан. Гидрохлорид А735512 фактор В агли кона в системе бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода (15:10:3:12) имеет Rj равное 0,80, полученное при помощи тонкослойной хроматографии на целлюлозе с алюминиевым носителем. Гидрохлорид А-35512 фактор В агли кона имеет R равное 0,26, которое получено цри. помощи тонкослойной хро матографии на силикагеле с использованием в качестве растворителя смеси метанол-хлороформ-концентрированная гидроокись аммония (3:2:1)., А-3-5512 фактор А агликон (свободное основание) является белым аморфным соединением, имеющим элементарный состав (усредненный),%: углерод 52,65; водород 4,57; азот 6,91; хлор 2,94; кислород 27,04; кальцинированная сода 4,70. Инфракрасный спектр поглощения А-35512 фактор В агликЬна. (свободное основание) в таблетке из KB г имеет значительные пики поглощения на следующих частотах, см : 3360 (интенси ный), 3260 (изгиб), 2940 (изгиб), 1735 (изгиб),1660 (интенсивный), 1598 (умеренный), 1510 (интенсивный) 1440 (умеренный), 1295 (слабый), 1215 (умеренный), 1165 (умеренный), 1122 (слабый), 1070 (слабый), 1018 (интенсивный), 940 (слабый) и 920 (слабый). Электрометрическое титрование А-35512 фактор В агли.кона (свободное основание) в 66%-ном водном растворе диметилформамида.указывает на присутствие пяти титруемых групп с значениями рК , приблизительно равны ми 6,2; 8,2; 10,1; 11,4; 12,4, ина возможное присутствие одной или двух дополнительных групп с значениями ГК превышающими 12,5. А-35512 фактор В агликон (свободное основание) имеет следующее характерное вращение: oL -64,5 (СЗ, DMSO). Ультрафиолетовый спектр поглощения А-35512 фактор В агликона (свободное основание) показывает в нейтральном и кислом метаноле максимум поглощения в 282 им ( 43,65) и в щелочном метаноле -максимум поглощения в 301 нм ( 67,46). Значения А-35512 фактор В агликона (свободное основание) совпадают со значениями гидрохлорида А-35512 фактор В агликона. П р и Me р. Таблетку лиофилизированного Streptomycescandfdus NRR78156 растворяют в 1-2 мл стерильной воды. Далее этот раствор используется для прививки культуры на наклонном агаре N 2, содержащем экстракт солода дрожжей Бакто. LSP ( лаборатории Difco, Детройт.. Мичиган), Привитый агар в течение семи дней вырапшвают при температуре . Со зревшую на кулйтуру покрывают водой (2 мп) и соскабливают при помощи стерильной пипетки, с тем, чтобы разрыхлить споры. Порция (0,1 мл) этой водной суспензии, содержащей споры, используется для прививки другого косого агара LSP № 2. Этот привитый агар выращивают в течение семи дней при . Созревшую на агаре культуру покрывают водой (5 мп) и соскабливают при помощи стерильной пипетки с тем, чтобы разрыхлить споры. Порция (2,5 мл) полученной суспензии спор используется в качестве прививочного материала для прививки 50 мл вегетативной среды, для выращивания культуры, имеющей следующий состав: соевый бульон Frypt lease (биологические лаборатории в Валтиморё,. Кокисвилл, Мериленд) 30 г, вода (деионизированная) 1л. Привитую среду для выращивания культуры инкубируют при 30°С в течение 48 ч в 250-миллиметровой колбе Эрленмайера, находящейся на вибраторе, имеющем скорость вращения 250 об/мин. Выращенный инокулят (0,5 мл) используют для повеса 50,мл среды следующего состава, г/л: Декстрин тапиоки 25,0 Глюкоза10,0 NH4N032,5 КСЕ1,5 MgS04 -1/1 FeC.,3 ZnCt.2.0,3 ,1,0 L-Глютаминовая кислота ,0,1 DL-Цитруллин,ОД СаСО-г, .5,0 Деионизированная вода1 л Привитую среду инкубируют при 32°С в течение 8-10 дней в колбе Эрленмайера объемом 250 мл на упомянутом вибраторе. Ферментацию проводят на среде для выращивания культуЕЫ, имеющей следующий состав, г/л: декстрин тапиоки 75,0; меласса 40,0; растворимый мясной пептон 15,0; о 0,5; CaCO 2,0; Н,2.0 1 л. Отделение А-35512 антибиотической смеси. Культуральную жидкость с продукта мк ферментации фильтруют с использованием ускорителя фильтрования (Hyf Super-cell диатомовая земйя, фирма Джон-Мэнвилл Продайте), при этом рН 6,8-7,2. Полученный таким образом прозрачный фильтрат пропускают через колонну, содержащую 10 мл полимерного адсорбента {Ambertete XAD-, фирма Ром и Хаас) на 100 мл фильтрата, со скоростью 150 мл/мин. Получен ные таким.образом фракции исследуют на биологическую активность против Sarclna lutea с использованием извес ного способа отбора проб на диски. Биологически неактивный эффлюент отбрасывают. Затем колонн промывают водой (1/8 от объема культуральной жидкости) со скоростью 150 мл/мин. Неактивная промывочная вода отбрасывается. Затем колонну элюируют 50%-ным водным раствором метанола (600 л) со скоростью 200 мл/мин. Элеат, содержащий А-35512 антибиотическую смесь, концентрируют под вакуумом до объема в 15 л, в котором содержится около 200 г А-35512 антибиотической смеси на литр. Разделение различных факторов в А-35512 антибиотической смеси. А-35512 антибиотическая смесь (около 3000 г, растворенных в 15 л метанола), полученная .как описано вы ше, подвергается хроматографии на полиамид ной колонне (Воэльм, 100 л) Затем колонна элюируется при помощи деионизйрованной воды со скоростью окол© 80-120 мл/мин. Фракции исследуют с использованием целлюлозной тонкослойной хромато графии или бумажной хроматографии, а в качестве растворителя используют смесь, п-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода (15:10:3:12), кроме то го,осуществляется биоавтография для Sarcina lutea. Первые 100 л элюата отбрасывают. Затем скорость потока изменяют до 160-200 мл/мин при этом осуществляют отбор фракций, объемом 12 л. Этим способом отбирают двадцать 12-ллтровых объемов. В этот момент меняют элюирующйй растворитель, вернее. Процентный со став его ингредиентов,при этом осуществляют следующие операции: содержимое контейнера (360 л метанола) сифонируют в контейнер, содержащий 120 л воды: В контейнере для воды смешанный раствор перемешивают, и направляют в колонну. После этого производят сбор двадцати четырех объемов (в 24 л каждый) при скорости потока 200-300 мл/мин. На основе рез-ультатов биоавтогра фии, группы объемов соединяют и выпаривают до сухости под вакуумом, в результате этого получается дигидрохлорид А-35512 фактора В и. следующая обогащенная смесь факторов: Объемы Объем, л - Фактор (S) Вес, г Очистка А-35512 фактора В. Частично очищенный дигидрохлорид А-35512 фактора В (400 г), растворяют, в 1,2 л 50%-ного водного раствора метанола и производят хроматографии на колонне, содержащей окись алкяииния, которая приготавливается следующим образoiyi: кислотообразующий окисел алюминия (100 кг, М.Воэльм) перемешивают в 50%-ном водном растворе метанола. После, того, как смесь отстоится, образующийся сверху раствор сливают и удаляют. Окись алюминия снова перемешивают с 50%-ным водным раствором метанола, а затем помещают в колонну, имеющую диаметр 13,5 см. Теперь колонна-, содержащая окись алюминия, промывается водным раствором метанола (50%-ным) до тех пор, пока; не появится прозрачный эффлюент. Колонна элюируется 50%-ным водным раствором метанола со скоростью около 8-10 мл/мин, при этом осуществляют сбор фракций объемом около 240-300 мл. Фракции исследуют при помощи тонкослойной хроматографии. На основании этих данных фракции соединяют, при этом выход очищенного дигидрохлорида А-35512 фактора В в зависимо.сти от номера фракции распределяется следующим образом: фракции. 17-21 - 9,6 г; фракции 2229 - 72,0 г; фракции 30-37 - 117,0 г. Каждая из них кристаллизуется из концентрированного 50%-ного водного раствора метанола при . Очищенный таким образом дигидрохлорид А-35512 фактора В содержит около хлора. Раствор дигидрохлорида А-35512 фактора В в 66%-ном водном растворе димет ил формами да имеет рН 6,5. Получение А-35512 агликона. Дигидрохлорид А-35512 фактора В (5,0 г) растворяют в .в.оде (200 Мл). Этот раствор подкисляется при помощи 4Н раствора соляной кислоты (14 мл). Полученный в результате раствор подвергают дефлегмированию в течение 2ч. Затем раствор охлаждают и выпаривают под вакуумом до объема, составляющего 3/4 первоначального оЬъема. Затем в полученный раствор покапельно добавляют соляную кислоту (6Н) до тех пор, пока не закон чится образование осадка. Полученный в результате осадок отделяют и сушат, в результате получается 3,56 г неочищенного гидрохлорида А-35512 агликона. Неочищенный А-35512 агликон очищают при помощи хроматографии на окиси алюминия, промытой кислотой с использованием в качестве растворителя раствор вода-метанол (1:9). Элюирование колонны сопровождается анализом при помощи целлюлозной тонкослойной хроматографии. Элюированные фракции, содержащие А-35512 агли кон, смешивают и выпаривают под вакуумом, в результате получается 398 мг частично очи14енного продукта Сравнение результатов тонкослойной хроматографии с использованием для анализа струи нингидрина, показывает, что примеси не являются биоактив ными . Порция этого частично очищенного А-35512 агликона (100 мг) проходит дальнейшую очистку при помощи хрома тографии Над полиамидом (4,г, фирма Машери, Нагель и К°, МИ-5С-6), (фир ма Бринкман Инструмент, О,07 мм) и элюируют водой. Эта колонна также подвергается анализу при помощи целлюлозной тонкослойной хроматогра фии, как это было описано выше. Элюированные фракции, содержащие А-35512 фактор В агликон, смешивают и лиофилизируют, в результате получается 64 мг очищенного гидрохлорида А-35512 фактор агликона. Общий выход составляет 5,08% от исходного А-35512 фактора В. . Получение А-35512 фактор В аглик на в форме свободного основания. Гидрохлорид А-35512 фактор В агликона (90 мг) растворяют в 30 мл смеси метанол-вода (1:1). Этот раст вор нейтрализуют при помощи ионо-об менной смолы (3,5 мл В i О -Rod « АG- 3 (Х(). Полученный в результате раствор перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем смолу удаляют при помощи фильтрации. Фильтрат концентрируют под вакуумом, при этом поддерживают температуру :менее 60 С до объема,составляющего половину первоначального, затем лиофилизируют, в результате получается 68 мг А-35512 фактор В агликона в форме свободного основания . Предлагаемый способ позволяет получать вещество, обладающее антибиотической активностью против возбудителей кариеса зубов и лечебным эффектом от прьвдей. Формула изобретения Способ получения агликона антибиотического А-35512 .фактора В, включающий выращивание организмов вида Streptomyces candidus NRRL8156 или их мутантов, вырабатывающих антибиотическую смесьА-35512, отделение смеси А-35512, выделение А-35512 фактора В, от л и ч а йщ.и и с я тем, что, с целью получения агликона А-35512, фактор В гидролизуют 0,051,5 нормальной органической или минеральной кислотой в течение 0,5-12ч. Источники информации, . принятые во внимание при экспертизе 1.Бражникова М.Г. и др. Ристомицин и его применение в клинике. М., Медицина, 1965, с.21-23. 2.Блинов И. О. и Хохлов А. С. Бумажная хроматография антибиотиков, Наука, 1970, с.252-253 (прототип).