Способ получения веществ, обладающих антипаразитарной активностью Советский патент 1980 года по МПК C12D9/14 C12D13/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИПАРАЗИТАРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

номер NRRZ 8165. Образец NRRZ 8165 был также депонирован в постоянной коллекции Американской коллекции типовых культур в Парклаун Драйв Мериленд 20852 и получил порядковый номер АТСС 31, 267.

Морфологические и культуральные характеристики следуюмие. Морфолог спорофоры образуют спирали в виде боковых ветвей воздушного мицелия. Спирали компактные, но делаются более открытыми по мере старения культуры. Споры-цепочками не более чем в 15 спор, обычно имеют сферическую или овальную форму (при увеличении в 970 раз). Спорообразован наблюдается в агаое с овсяной му;кой, с глицерином-аспарагином, с солями, крахмалом и с яичным альбумином. Поверхность спор гладкая. Агар с овсяной мукой; обратная сторона - темно-коричневая. Воздушный мицелий: порошковый коричневато-серый (41) ,(обоз.начения номера,цвета взяты из Co2pr Hermany Митеов, 1б5в/1-th tdftion Conteiner ot АгпеНсд, Chlcogo, OU. смешанный с белым. Растворимый пигмент; коричневый Лапек Доке агар (сахароза-нитрат). Вегетативный рост; плохой,

бесцветный.

Воздушный мицелий скудный,

сероватый.

Растворимый пигмент; сероватокоричневый светлого тона. Яично-альбуминный агар: вегетативный рост умеренный, светло-серовато-желтовато-коричневый (В оеГГ смешанный с белым.

Растворимый пигмент: светло-сервато-коричневый .

Глицерино-аспарагиновый агар, веге.тативный рост; обратная сторона желтовато-коричневая. ,

Воздушный мииелий; порошковый коричневато-серый (411), смешанный о белым.

Растворимый пигмент: светлый, желтовато-коричневый.

Неорганические соли - крахмал.

Вегетативный рост: обратная сторона серовато-желтовато-коричневая.

Воздушный мицелий: порошковый, светлый, коричневато-серый (411) по краям более темно-коричневатосерый (4li }.

Растворимый пигмент: светложелтовато-коричневый.

Агар с дрожжевым экстрактом-декстровой-соли.

Вегетативный рост: обратная сторона темно-коричневая.

Воздушный мицелий: умеренный, коричневато-белый.

Растворимый пигмент: коричневый Агар с пентоно-железо-дрожжевым экстрактом.

Вегетативный рост; темно-коричневый.

Воздушный мицелий: нет.

Растворимый пигмент; от темнокоричневого до черного.

Миланин: положительная реакция.

Выделение положительная ре.акция.

0

Агар с дрожжевым экстрактом мальтэкстрактом.

Вегетативный рост: обратная сторона темно-коричневая.

Воздушный мицелий: умеренный,

5 коричневато-белый.

Растворимый пигмент; коричневый. Питательный ага.р.

Вегетативный рост: коричневый.

Воздушный мицелий: скудный, 0 сероватый.

Растворимый пигмент; светло-коричневый..

Питательный крахмальный агар. .

Вегетативный рост: коричневый. 5Воздушный мицелий; скудный, серовато-белый.

Растворимый пигмент-; светло-коричневый.

0Гидролиз крахмала; хороший.

Картофельная масса.

Вегетативный рост: коричневый.

Воздушный ьетцелий: коричневый, смешанный с серовато-белым. 5 Сыворотка крови Лефлера.

Вегетативный рост: сероватокоричневый.

Воздушный мицелий: нет.

Растворимый пигмент: некторое , потемнение среды.

0

Разжижение: нет. Питательный тирозиновый агар.

Вегетативный рост:- обратная сторона от темно-коричневой до черной.

5Воздушный мицелий: скудный,

сероватый.

Растворимый пигмент: темно-коричневый.

Разложение тирозина; нет. Q Усвоение - углерода.

Основная среда Придгема Готтлиба 1 1% источника углерода -f (+ рост, - нет роста, в сравнении с контрольной без источника углерода) .

5

Глюкоза +маннитон +

Арабиноза +манноза +

Пеллюлоза - ФаЛиноза + Фруктоза +рамноза +

Лактоза +сахароза +

0 Мальтоза +ксилоза +

Инозитол + Питательный желатиновый агар.

Вегетативный рост: KopHiHeBFjA.

Воздучный мицелий: скудгый, 5 серовато-белый. Растворимый пигмент: светло-ко невый. Разжижение желатины: хорошее, Желатина (посев уколом). Вегетативный рост: коричневое кольцо. Воздушный мицелий: нет. Растворимый пигмент: зеленоват коричневый , Разжижение желатины: полное. Агар-снятое молоко. Вегетативный рост: темно-корич невый. Воздушный мицелий: нет. Растворимый пигмент: темно-коричневый. Гидролиз казеина: хороший. Лакмусовое молоко. Вегетативный рост: темно-корич вое кольцо роста. Воздушный мицелий: нет. Цвет - темно-коричневый. Коагуляция и/или пептонизация: полная, делается щелочной (рН 8,1 Снятое молоко. Вегетативный рост: темно-корич вое кольцо роста. Воздушный мицелий: нет. Растворимый пигмент: темно-кори невый. Коагуляция и/или пептонизация: полная пептонизация, делается щело ным (рН 8). Температура: (агар с дрожжевым трактом + соли): - хороший вегетативный рос и воздушный мицелий, - хороший вегетативный рос ;и воздушный мицели-й, - роста нет. Потребность в кислороде: (культ уколом в агаре с.дрожжевым экстрак том + соли). Аэробная культура. Все определения производились через три недели при , если Не оговорено иначе. Значения рН йсех сред почти нейтральные (6,8-7 При ттательном сравнении этих.д ных с опубликованными описаниями, включая Руководство по определен ной бактериологии Беркея (8 издани известных микроорганизмов, обнаруживаются значительные различия, указываюиие ,что данный микрооргани должен быть классифицирован как но вид. На этом основании он был назван Streptomvces C(vermUi is. С-076-соединения получают при ферментации подходящей водной пита тельной средн штаммом Streptomvces c в описываемых далее условия водные среды, применяемые для получения многих антибиотиков, являются также пригодными для данного процесса получения С-076-соединеНи Такие питательные среды содержа Источники углерода и азота, ассими лируемые микроорганизмами и неболь 1ише количества неорганических солей. Кроме того, ферментационные среды могут содержать следы металлов, необходимых для роста микроорганизма. Они обычно присутствуют в виде комплексных соединений источников углерода и азота, применяем-ix в качестве источника питания, но их можао добавлять к среде отдельно. Такие углеводы как сахар, например декстроза, сахароза, мальтоза, лактоза, декстран, церелоза, и т.п. и крахмалы являются хорошими источниками ассимилируемого микроорганизмами углерода в питательных средах. Количество источника углерода, применяемого в среде, частично зависит от количеств других компонентов среды и обычно составляет 0,5-5вес.% от количества средыи считается достаточным. Источники углерода можно применять отдельйо,или их можно комбинировать в среды с другими компонентами. При образовании С-076-соединений легко ассимилируемых штаммом 5trep omvces civermitiPis применяют такие различные источники азота, как дрожжевые гидролизаты, дрожжевые автолизатн, соевая мука, гидролизат ы казеина, дрожжевые -экстракты, жидкости для замочки кукурузы, кукурузная барда, мука хлопковых семян, мясные экстракты и т.п. Можно применять или один источник, азота, или в комбинации с другими соединениями в количестве 0,2-6 вес.% среды. Из питательных неорганических солей,которые можно вводить в культуральные -среды, можно назвать обычные соли, способные давать ионы натия, калия, магния, аммония,кальция, фосфата, сульфата, хлорида, -карбоната и т.п. Вводятся в соеду также леды таких металлов, как кобальт, арганец, железо и т.п. Далее приедены примеры сред, поиголннх пля выра11ивания штаммов siceptomvces ovcrmitiPis с целью получения С-П76. соеиненийСреда А. Кукурузная мука, г20,0 Соевая мука,г15,0 Барда,г10,0 Цитрат натрия, г4,0 . , г0,5 Полигликоль Р 2000,мл2,5 , г0,1 СаС12бН„0, г0,01 FeSO. , г0,01 Дистиллированная вода, мл рН 6,51000 Среда В Растворимый крахмал,г20,0 ХСидкость от замочки кукурузы, г15,0 Перелоза, г5,0 Соевая мука, г4,0 (N H)SO , г4,0 Кукурузная мука, г1,0 Соевое масло, мл2., 5 КН РО , г0,3 CaCOj, г6,0 Дистиллированная вода, млрН6,71000 Среда С Томатная паста, г40,0 Оваяная мука, г15,0 Дистиллированная вода, мл рН 6,01000 Овсяная мука, г20.,0 Томатная паст.а, г20,0 Дистиллированная вода, мл рН 5,5 .1000 Среда Е Декстроза, г10,0 Пептон (фирг-ы ДИЛко Лабораториз Детройт), г 5,0 Дрожжевой автолизат, г 3,0 (Ардамин оН Лирмы Ист Продактс Инк, Патерсон) NaCJ, КСЬ, г0.72 FeSO ( SO 6Н,О. 0,035 МдС1г-бНг.О/г5,32 СаС2. 2 Н,0, гО/73 Дистиллированная вода, мл рН.7,41000 Ферментацию с применением микро организмов, образующих С-07б-соеди нения,можно проводить при 20-40 С Дпя получения оптимальных результа наиболее целесообразно проводить эти ферментации при температурах 2 4-30°С, Наиболее предпочтительны температуры 27-28 С. рН питательно среды, пригодной для получения С-0 соединений, можно менять в предела 5,0-9,0 предпочтительно 6,0-7,5. Ферментации в небольших коли-, чествах удобно проводить в колбе в стерильных условиях, заражая пита тельную среду спорами или вегетати ными клетками штамма Slt-eptomvces av miWis образующего С-076-соединени Колбу затыкают ватой и выдерживаю при постоянной температуре и взбалтывании в течение 3-10 дней. При работе с большими количествам ферментацию рекомендуется проводи в сосуде, снабженном мешалкой и у тройством для аэрирования питател ной среды. Питательную среду гото вят в сосуде, стерилизуют и затем заряжаиот источником вегетативного клеточного материала штамма Strepto ces Qvermitieisобразуго его С-0 соединения. Ферментацию продолжаю 1-8 дней при перемешивании и/или аэрировании питательной среды при температуре 24-37°с, скорости перемешивания95-125 об/мин и при подаче воздуха 1,8-18 . Получаемые по изобретению новые вешества, называемые здесь С-076вешествами, находятся по окончании ферментации главным образом в мицелии и могут быть извлечены и отделены как описано выше. Выделяют четыре главных и четыре второстепенных компонента С-07б-соединениГ, образуемых Streptomvces overmUieis .Идентифицировано восемь различных соединений С-076, Ala, А1в, А2а, А2в, В1а, В1в, te2a, В2в. Главные компоненты обозначены 1буквой1 а, второстепенные буквой в. Структурные различия между соединениями айв должны быть одинаковыми для каждой из четырех пар. Как и следовало ожидать, даже главные С-076-соединения не образуются в одинаковых количествах при описанных здесь условиях ферментации. Так, А1 соединения составляют 20-30 вес.% от общего количества получающегося комплекса С-076, соединения А2 составляют 1-20 вес.%-, соединения В1 и В2 каждое 25-35%. Весовое соотношение рядасоединений к ряду соединений в равно 85-15 - 99:1. Отделение соединений С-076 от всей Ферментационной массы и извлечение индивидуальных компонентов . производится экстракцией растйорителем и хроматографическим фракционированием различными хроматографическими методами и с различными системами растворителей. С-076-соединения слабо растворяются в воде и хорошо в органических растворителях. Это свойство используют для извлечения их из ферментационной среды. Так, по одному способу извлечения всю ферментационную массу отфильтровывают и водный фильтрат выбрасывают. Затем отжатый влажный фильтровальный остаток мицелия экстрагируют подходящим растворителем. Хотя и можно применять любой органический растворитель, лучше применять растворитель, смешиваюшийся с водой, например ацетон, метанол, этанол и т.д. Для достижения максимального извлечения рекомендуется многократная экстракция. Растворителем извлекаются активные компоненты С-076,а также вещества, не обладающие антипаразитической активностью соединения С-076. Если растворитель смешивается с водой, то воду также удаляют из влажного мицелия.Экстрагированный мицелий можно отбросить.Экстракты упариваот для удаления органического растворителя и экстракцию повторяют несколько раз с другим растворителем. Если

при первой экстракции применяют. сМ5 шивающийся с водой растворитель, то при второй экстракции предпочтительнее применять не смешиваю1цийся с водой растворитель, например хлороформ, хлористый метилен, четыреххлористый углерод, этилацетат, метилэтилкетон, метилизо(;утилкетон и т.п. Полученные экстракты высушивают и концентрируют обычными методами. Получают остатки, содержащие G-076-соединения с примесями других соединений. Затем эту фракцию хроматографируют для отделения активных. С-07б-соединений от прочего материала и также для выделения индивидуальных С-076-соединений. Хроматографируют на колонке с применением таких сред, как силикагель, окись алюминия, гели декстрана и т.п. и элюирование производя или различными растворителями и/или комбинацией двух или более раствори-

телей, взятых в различных соотношенкях. идкостную хроматографию применяют для открытия С-07Я-соединений и жидкостную1 хроматографию высокого давления можно применять для выделе ния очищенных фракций, содержащих одно или более соединении. Аналогично храматографию в тонком слое можно применять для обнаружения и выделения индивидуальных С-0 76-соединений. Присутствие активных С-076-соединений

0 определяется испытанием различных хроматографических фракций на антипаразитическую активность и также спектральными характеристиками этих соединений.

5

Спектральные и другие физико-химические характеристики индивидуальных G-076-срединений приведены в табл.1. Эти соединения хорошо растворимы в большинстве;обычных органи0ческих растворителей и обладают минимальной растворимостью в воде,

таблица i

Молекулярная ,, О,,с Н.О формула +48, 8° ±2° Оптическое +68,5 ±2 вращение {d} () (,77)

Молекулярная масса

(определена масс-спектрометрически).886

Ультрафиолетовые спектральные данные были получены с помошью ультрафиолетового спектрометра Кери, модель 15 в метанольных р-гствооах в кварцевых ячейках , площадью 1 см, Хотя ультрафиолетовое поглощение представлено как поглощение ряда а, фактически оно является поглощением соединений ряда а, содержащих (,64)

876

890

858

872

.примеси соединений ряда в. Ряды а и в различаются только числом -СН в. низкоалкильном заместителе и эта 60 .разница не связана с хромофором. Ультрафиолетовое поглощение в первую очередь характеризует степень и природу ненасыщенноети в соедине|Нии, Оптические врашения определяют, .именяя стандартные методы и поляС, Н,, Н О,С Н, , Ч. СдтНггО,; +55.°±2 ..+38,. (,06)(,87)

оиметр Гейсса. Фактор концентрацииприменении тетраметилсилана в ка(с) дается как количество соедине-честве внутреннего стандарта. Обьем

ния в данном растворителе, выражен-раствора и концентрации образцов

нов в процентах..указаны в каждом случае с последуюДанные ЯМР-спектра 13С для С-076 5 но тетраметилсилана для каждого соеА1а, А2а: В1аИ В2в приведены в табл.2. динения, данными в частях на миллион. Спектры получены с помощью спектро-Химические сдвиги даются для отдельметра ядерного магнитного резонанса.ного атома углерода, если не оговореВариант модели СЕТ-20 в дейтерирован- но иначе, в скобках после химического ном хлороформном растворителе при.Q , 11,612,413,815,1 .17,7

щими химз ческими сдвигами относительТаблица218,4, 19,920,227,3 Характеристики масс-спектральных пиков восьми С-076-соединений приво,дятся в табл.3. В первой строке та(5лицы представлено отношение массы к 1 за|5яду. (м/е) молекулярного иона, каждого соответствующего соединения и остальные цифры дают отношение массы к заряду главных фрагментов каждого соеданения. Отношения масс к заряду находящихся в одном горизонтальном ряду, указывают аналогичные фрагмен;ТЫ каждого соединения. ,Основываясь на экспериментальных данных,исследованиях и измерениях, описанных здесь, считается, что ;С-П76-соединения должны иметь следующую структурную формулу: R-0 LLJ

Продолжение табл,2 .(Лз где R- у- -олендрозил- JT -1 -олеандрозид структуры «Нз НО и где пунктирная линия указывает простую или двойную связь; R - оксигруппа, которая присутствует только тогда, пунктирная линия указывает на простую связь, R - бутил или пропил и R- -метокси- или оксигруппа. Индивидуальные соединения, вхоящие в эту структурную Лормулу, оиволятся ниже: 15 Соединения, в которых Rj -бутил (соедяиения ряда а) и соответствующие соединения, в которых- П. пропил (соединения ряда в) ведут себя одинаково в большинстве процессов извлечения, например при экс тракции растворителем, В каждой паре соеда1нений а и в соединение а находится в большем количестве и обычно составляет 85-99% смеси соединений а-и в . Присутстви пропиловых соединений подтверждается .масс-спектрами соединений, где пики представляют собой Фрагменты, содержащие бутильную группу, имеют парные пики с массой на 14 единиц (или одну -CHj) меньше. В дополнение следует отметить, что для отделения компонен тов В1в от компонентов Ala применяли жидкостную хроматографию высокого давления и масс-спектр такого А1в-со динечия подтверждался масс-спектроме рией высокого разрешения (см.табл.3) : Новые соединения,полученные по изобретению, имеют значительную паразитицидную активность, как антигель мнты, инсектицидь и акарициды, д1ля животных и в сельском хозяйстве Как готовые препараты эти соединения можно назначить внутрь, например в виде капсуль больших пилюль или таблеток в виде -жидких обильных доз антигельминтов для млекопитающих. Такие .отдельные дозы могут широко изменяться по общему весу и содержанию антипаразитического агент в зависимости от таких факторов, ка паразит, подлежащий уничтожению, силы и типа инфекции и веса тела жи вотного. Применять предлагаемые соединени можно или как очищенные индивидуаль ные С-076-компоненты, или в виде примесей двух или трех индивидуальны компонентов, поэтому нет необходимо ти тщательно разделять различные С-076-соединения, полученные после очистки ферментационной среды. Обыч но для предупреждения переносимых паразитами заболеваний применяют смесь, содержащую два или более С-076-соединений, но без примесей других соединений. Такая смесь обычно содержит С-07б-соединения в произвольных соотношениях, но все они обладают значительной активностью. Антипаразитическая активность может быть точно определена. В част ности, необязательно отделять компоненты в от родственного компонента в. Такие соединения отличаются только длиной 25-ой боковой цепи. Разделение таких родственных соединений оРычно не производится, так как соелинение в присутству ет лишь в виде примеси. С-076-соединения при добавлении к корму животнмх можно использовать в виде жмыхов мицелия Лермснтационной среды. Поскольку мицелий достаточно активный и уровень активности мицелия можно определить, его можно добавлять непосредственно к корму животных, Пример 1, Среда 1 Томатная паста20 г/л Дрожжи10 г/л Крахмал модифицированный, СоСд,а. г/л Полигликоль 20000,321 мп/л ДистиллированнаяДостаточвода рН 7,2-7,4ное количествоСтадия. А. 50 MJI среды 1, пометенной в колбу Эрленмайера емкостью 250 мл, инокуируют замороженной ампулой Streptomvces overmitiPis MA 4680. Колбу йнкубируют при при вращении взбалтывателя со скоростью 160 об/мин по кругу диаметром 50 мм в течение 24 ч. Стадия В. 500 мл среды 1, содержащейся в вухлитровой колбе Эрленмайера, инокулируют 10 мл содержимого колбы стаии А. Среду инкубируют при при вращении взбалтывателясо скоростью 150 об/мин по кругу диаметром 50 мм в течение 24 ч. Стадия С. В бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 189 л заливают 160 л среды 2 и добавляют 500 .мл посевного материала, полученного на стадии В. Чан инкубируют при 28°С при вращающейся со скоростью 150 об/мин мешалке в течение 24 и скоростью аэрирования 2,7 м/мин. Среда 2. Декстроза, г/л 1 Крахмал кукурузный, 10 г/л Мясной экстракт, г/л Автолизированные дрожжи, г/л MgSO -7H2O, г/л . 0,05 г/л О,10 , О, 182 Достаточное Дистиллированная вода рН 7,0-7,2 количество . Стадия Д. В бродильный чан из нержавеюшей стали емкостью 756 л заливают 457 л среды 6 и добавляют 43 л материала прививки, полученного по стадии С. Чан инкубировали при 28°С при перемешивании и скорости вращения мешалки 114 об/мин и аэрирование при скорости потока воздуха 9 . Стадия 3. Крахмал продажный, СРС, г Модифицированный (фирмы СРС Корп, г 40,0 Барда, г7,0 A ВТ о ли зиро в энные дрожжи (фирмы Ист5,0 продактс инк), г CoCijj-SHjO, мг50 Дистиллированная1000 вода, мл рН 7,3 Стадия Е. По окончании этого всю культура ную среду отфильтровывают и оставш ся на фильтре жмых, содержавши С-0 .соединения , промывают водой. Затем его взмучивают в 120 л ацетона в течение 30 мин, отфильтровывают и промывают 30 л ацетона. Ацетоновые экстракты объединяют и выпариваю: п пониженном давлении до объема 40 л Разбавленной соляной кислотой рН концентрата доводят до 4,0. Концент экстрагируют 3 раза произвольными количествами хлороформа. Хлороформные экстракты высушивают пропускаТш емчерез слой инфузорной земли (Сап Сел) . Объединенные экстракты концентрируют при пониженном давлении до 4 л. Хлороформный концентрат фил .труют и загружают в колонку, заполненную 2,9 кг сйликагеля в хлорофор ме. Колонку элюируют хлороформом, собирая восемь фракций по 3,5 л каждая. Затем колонку элгоируют смес ;хлороформ: метанол-(49:1) , собирая еще восемь фракций по 3,5 л; (Фракции 9-16). Фракцию 3 упаривают досу ха и получают 76 г маслянистого Bee ства, содержащего главным образом С-076-соединения. 97% этого продукта растворяют в 685 мл хлористого метилена и хроматографируют на 600 г кремнекислотн. Колонку (диаметр 7,3 мм,длина 36см) проявляют 7,5 л смеси хлористого метилена и бензола (7:3) и зат 2,26 л смеси хлористый метилен бензол-7:3 с добавкой 5% изопропанола. Фракция, элюированная смесью хлорис ;го метилена с бензолом с добавкой 5 изопропанола,имеет четко окрашенную полосу и содержит фактически весь материал С-076, как это РЫЛО определено хроматографией в тонком слое (см.пример 5). Эту фракцию объемом (500 мл) упаривают и снова хроматографируют на 105 г кремнекислоты (диаметр колонки 3,7 см, длина 18 см) в хлористом метилене. Колонку проявляют тремя порциями хлорист го метилена по 100 мл, содержащего 4,10 и 20% эфира. Дальнейшее элюиро ние хлористыг/1 метиленом с содержани ем 20% эфира дает 2 окрашенных полосы. Фракция между двумя полосами фактически содержит весь С 076-материал, как это установлено с помощ хроматографии в торжом слое. Фракцию, содйржащчто С-076, хроматографируют на 59 г коемнекислоты 1 (дламетр колонки 3,7 см, длина 11 см в хлористом метилене.. Колонку промывают хлористым метиленом, содержащим 10% эфира. В начале элюированяя отбирают фракции по 70 мл и затем отбирают 26 фракций по 5-6 мл. Фракции 3-26 объединяют и получают 1,35 г материала, его анализируют хроматографией в тонком слое (силикагелевые пластинки Аналтак G F 254, проявленные хлористым метиленом, содержащим 5% изопропанола. Веществом, имеющим Rf 0,28 является С-076 А1. : Колонку элюируют хлористым метиленом, содержащим 20% эфира (200 мл), затем хлористым метиленом, содержащим 50% эфира (800 мл). Получают небольшое количество смеси С-076 А1 и А2 и все остальное количество С-076 А2. Вес С-076 А2 800 мг. При дальнейшем элюировании хлористым метиленом, содержащим 5% изопропанола, получают 135 мг С-076 В1. Разделение производят по ультрафиолетовому поглощению элюата.С-07Р В1 и А2.имеют очень близкие величины Rf на силикагелевых пластинках хрома-, тограмм в тонком слое (аналтак G F 254) и хлористом метилене с 5% изопропанола. Однако оба компонента ясно различигфй на -тех же пластинках, проявленных гексаном, содержарщм 10% изопропанола. Всю фракцию С-076 А1 наносят на 14 силикагелевых пластинок (аналтак CF 254, 20 X 20 см, толщина 500 мкм). Пластинки проявляют гексаном с 10% изопропанола. Полосу, содержащую С-076 А1, удаляют с пластинок, экс- трагируют эфиром и снова наносят на 6 пластинок и 5 раз проявляют гексаном, содержащим 5% изопропанола. С-076 А1 удаляют с пластинок, снова хроматографируют, проявляют чистым эфиром и получают 270 мг почти чистого С-076 А1. ИК- и ЯМ -спектры этого образца приведены в табл.2. Фракцию С-076 А2 хроматограФируют на 10 силикагелевых пластинках (аналтак HF 254), проявляют 5 раз гексаном, содержащим 15% изопропанола и получают 265 мг почти чистого С-076 А2, ИК- и ЯМР-спектры образца этого вещества приведены в табл.2. , Фракцию С-076 В1 хроматограЛируют на 2 силикагелевых пластинках (как казано вьлие) гексаном, содержащим 15% изопропанола и получают 55 мл почти чистого С-076 В1. ЯМР-спектр того образца приведен в та«л,2. Пример 2. Ферментацию, опианную в примере 1, повторяют дважы и обе среды объединяют. Ферментаионную среду обрабатывают та.к,-клкписано в примере 2, получая 3,3 л ервоначального хлпроЛормпого экстряка, который содержит 60 мг/л всех вердых веществ и по даннмм хромаографии в .тонком слоо О, Т,-со1 -л;+ени{ С-076 .

3 л этого хлороформного раствора хроматографируют на 2400 г силикагеля (Девидсон, сорт 62) в хлороформе. Колонку (.9,5x122 см) проявляют восемью порциями по 3800 мл хлороформа (фракции 1-3), затем восемью порциями по 3800 мл смеси хлороформ: метанол-49:1 (фракция 9-16). Индивидуальные фракции анализируют хроматграфией в тонком слое (силикагелевые пластинки Кванта/Грамм 01Г), проявленные хлороформом: метаноломз el9:l. Каждую из фракций 9-11, 12-13 и 14 выпаривают досуха- и получают 6,63 г твердых веществ, содержащих С-076А компоненты,во фракциях 9-11 24,9 г твердых веществ,содержащих С-076В компоненты,во фракциях 2-13 и 4,7 г твердых веществ,содержащих С-07бВ-компоненты во фракции 14.

Фракции 12-14 объединяют (29,62г) растворяют в 100 мл хлористого метилена и хроматографируют на 400 г силкагеля (Девидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонку элюируют iSOQ мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол-99:1, 1500 мл смеси хлористый метилен: 2-пропанол-49:1, 2000 мл смеси хлористый метилен:. 2-пропанол-19:1 и 1000 мл смеси хлористый метилен: 2-пропан6л-9:1. 2,56 г вещества, выделенного из элюата объемом 5500 мл, и 5,09 г, выделенного из элюста; объемом 60006500 мл, растворяют в 25 мл хлористого метилена и хроматографируют на 60 г силикагеля в гексане. Собирают головные фракции из 70 мл гексана и 100 мл смеси диэтиловый эфирг4:1 и затем колонку проявляют 600 мл смеси гексан: диэтиловый ,. отбирая фракции по 20 мл и затем элюируя 700 мл эфира и отбирая фракции по 100 мл. Из элюатов объемом 400600 МП получают1,035 г твердых веществ, содержаищх В1-компоненты С-076; из объемов. 600-1000 мл получают 0,881 г твердых веществ, со- ... держащих см.эсь компонентов В1 ,В2 0-076, и из объемов 1100-1500 мл получают 0,381 г твердых веществ, содержащих В2-компоненты С-076.

Смесь компонентов В1 и В2 затем растворяют в 4,2 мл смеси метанол: и хроматографируют на Порасиле С18 (Бонданак 37-75 мкм в том же растворителе. Из обратнофазной колонки высокого давления (сначала элюируются более полярные компоненты) размером 1,2 м х 16 мм элюируют. вещество со скоростью 800 мл/ч и отбирают фракции по 21,3 мл. Присутствие компонентов С-076 подтверждается наб.людением УФ-поглощения фракций. С-076 В2 весом 137 мг извлекают во фракциях 24-37 и С-076 В1 весом 195,4 г во фракциях 51-70, Затем каждый образец отдельно хроматографируют на колонках, заполненных 4 г силикагеля (Девидсон, сорт 62) в хлористом метилене. Колонки элюируют 35 мл смеси хлористый метилен: метанол 9:1. Последние 20 мл элюата из каждой колонки собирают, выпаривают досуха и получают 155,8 мг С-076 82 и 90 мг С-076 В1.

Затем 50 мл С-076 В1 и 100 мл С-076 В2 хроматографируют на препа0 Рэтивных силикагелевых пластинках

(Аналтак HF 254) извлекают гексаном, содержащим 12% изопропанола с последующим извлечением эфиром и получают почти чистые С-076 В1 и С-076 В2. Пример 3. 50 мл среды,

находящейся в колбе Эрленмэйера ем костью 25 мл, состава, вес.%:

Лактоза2,0

Барда.1,5

Автолизированные0,5

0дрожжи

рН перед стерилизацией 7,0 было инокулировано содержимым замороженной ампулы Streptomvces avermiti is MA 4848 и инкубировано во 5 вращающемся взбалтывателе при 28с в течение 24 ч при скорости вращения 150 об/мин.

. 10 мл этой ферментационной среды используют для инокуляции такой же 0 среды в двухлитровой колбе Эрленмейера. Ферментационная среда инкубировалась при 24 ч при 50 об/мин во вращающемся взбалтывателе.

Все эти среды затем применяют для

инокулирования 467 л соеды в бродильном чане емкостью 756 л состава,вес,%: Лактоза2,0

Барда .1,5

Автолизированные 0,5

дрожжи

Полигликоль 2000 мл,л. 0,32 рН перед стерилизацией 7,0 Ферментационную среду инкубируют при 40 ч пропусканием воздуха 5 (9 мЭ/мин) при перемешивании со скоростью 130 об/мин.

230 л этой среды используют для инокулирования находящейся в бродильном чане из нержавеющей стали емкостью 5760 л среды следующего состава,

вес.%:

Декстроза 4,5, Пептонизированное молоко .

f Автолизированные

дрожжи0,25

Полигликоль, мл/л 2,5 рН перед стерилизацией 7,0 Ферментацию продолжают 144 ч при 26°С путем пропускания воздуха 60 49 и перемешивании со скоростью вращения мешалки 120 об/мин.

Ферментационную среду отфильтровывают, фильтровальный жмых мицели.ч промывают 550 л воды и Фильтрат и $5 ;промывные воды, отбрасывают, Фильттровальный жмых взмучивают в тече ние 1 ч с 500 л ацетона и отфильтровывают. Отфильтрованный жмых про вают 150 л ацетона и 40 л воды и по лучают около 2000 л экстракта. Ферментацию и экстракцию повтор ют в тех же количествах и получают еще 2000 л ацетонового экстракта, который затем объединяют с первым экстрактом и упаривают до 800 л с помощью концентрированной соляной кислоты; рН концентрата устанавливают 4,7 и добавляют 800 л хлористо го метилена. Объединенные растворители перемешивают 4 ч и слои разделяют, К водному слою добавляют еще 600 л хлористого метилена и перемешивают 4 ч. Слои разделяют и каждый экстракт отдельно обрабатывают. Оба экстракта упаривают до общего объема 60 л. Пример 4. 60 л раствора из предыдущего примера упаривают досуха в вакууме для удаления остат ного хлористого метилена и к остатк 3 раза добавляют по 60 л метанола. Конечный объем метанольного концентрата 36 л. Метанольный раствор выд живают ночь и отфильтровывают. Филь ровальный жмых промывают 40 л свеже го метанола и фильтраты и промывные воды объединяют. Затем в метанольны раствор добавляют 95 л этиленгликол и 130 л гептана. Двухслойны раство промывают смесью 20 л этиленгликоля и 6,3 л метанола. Спустя 5 мин после перемешивания .нижний слойот:деляют и объединяют с первым этиленгликоль-метаноловым экстрактом. К этому экстракту добавляют равный объем воды (около 150 л), содержа щей 79 г соли на 1 л. Полученный раствор экстрагируют 150 л эфира и перемешивают в течение 5 мин. Эфирный слой промывают 75 л воды . (1/2 объема), перемешивают 5 мин и слои разделяют. Этот процесс повтор ют еще 2 раза (npONHBHafl вода содержит 20 г соли на 1 л). Эфирный слой упаривают в вакууме до мини мгшьного объема при температуре менее . К остатку добавляют 40 л хлористого метилена и раствор выпаривают досуха. Этот процесс повторяют и конечный остаток концен трируют в вакууме досуха. Пример 5. В колонку.диамет ром 20 см загружают слой 34 кг активированного глинозема и затем слой 34 кг активированного угля в хлористом метилене. Остаток из предыду цего примера растворяют в хлористом метилене доводя объем до 34 л, заливают в колонку и элюируют 34 л i хлористого метилена и эти фракции отбрасывают. В колонку подают 3%-ный раствор изопропанола в хлористом метилене (20,8 л изопропанола и 660 л хлористого метилена) и элюируют, отбирая фракции-200 л. Эти лракции упаривают в вакууме на бане, нагретой до , до объема 20 л. Затем снижают температуру бани до 45°С, экстракт выпаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 10 ч хлористого метилена, 10 ч гексана и 1 ч метанола до конечного объема 15 л. Этот раствор загружают непосредственно в колонку с Сефадексом Н-20. Пример 6. В колонку диаметром 30 см загружают 36. кг Сефадекса Н-20 и промывают смесью хлористый метилен: гексан: метанолгЮ: 10:1. В колонку заливают 0,25 раствора С-076 и элюируют со скоростью 250 мл/мин. Отбирают две первые фракции по 20 л, которые отбрасывают и затем 20 фракций также по 20 л. Последнюю фракцию .также выбрасывают. Выло найдено, что фракции 1-8 содержат С-076-соединения А- и фракции 9-10 В-соединенйя. 680 г этого образца растворяют в 2 л хлористого метилена, загружают в 22-лйтровую трехгорловуй круглодонную колбу и добавляют 13,6 л метанола. Затем хлористый метилен отгоняют в вакууме, одновременно дббавляя 13,6 л этилацетата. Скорость отгонки регулируют так, чтобы температура раствора была не ниже 65.°С. После добавления этилацетата раствор остывает при -16 ч. Кристаллы отфильтровывают и промывают 1 л холодного этилейгликоля. Затем кристаллы снова растворяют в 2 л хлористого метил.ена . и раствор загружают в 22-литровую трехгорловую круглодонную колбу,Эту процедуру повторяют дважды, В -первый раз применяют по 12,5 л метанола и этиленгликоля и во второй раз по 13,5 л. Полученные в конце кристаллы промывают I л холодного этиленгликоля и 1 л воды. Кристаллы растворяют в 4 .л воды и высушивают фильтрованием через сульфат натрия. Бензольный раствор концентрируют до 2 л, лиофилизируют и получают 341,2 г белого порошка, состоящего на 98% из С-076-В1 и 1% С-076-В2. Маточные растворы после -кристаллизации объединяют и разбавляют 22. л воды. Водный раствор экстрагируют 60 л толуола и снова ,15 л толуола, Толуольный экстракт затем промывают 48 л воды. Органи.ческую фазу фильтуют для удаления остатков воды, упаривают и получают 336 г твердого атериала, состоящего на 79 % из -076-В2 и на 16% из 0-07 В1-соедиЧений. .Пример 7. В четьтрех колонах, заполненных Сефадексом У. К-20, ак в примере 6, получают Фракции -8 и их объединяют. По данным, олученным с помощью жидкостной хроматографии высокого давления, было найдено, что смесь содерЛсит 252 г С-076 А2а, 16 г А2В, 94 г Ala и 24 г А1в, Полученный продукт растборяют в смеси растворителей гексан толуол: метанол - 6:1:1 и загружают в колонку со Сефадексом Н-20 такихt ;же размеров, как в примере 2. Фракц собирают при скорости элюирования 250 мл/мин, причем первые 20 л отбр сывают. Затем элюированием получают еще две 20-литровых первичных фрак ции, которые также отбрасывают и 50 фракций по 4 л, которые содержат С:;07б А-соединения. Было найдено, что | 1ракции 3-8 содержат преимус ественно ;А1 компоненты ( г Ala и 6,7 г А1в) и фракции 29-36 С-076 А2 соеди нения (117,2 г А2а и 7,35 г А2в). Фракции содержали смесь С-076 ,А1 и Л2 соединений. Пример 8. Образец С-076 :В1 из примера 7 весом 150 г растворяют в 3 л смеси гексан:толуол;метанолгЗ:1:1. Раствор пропускают через колонку с Сефадексом Х Н-20 ((таких же размеров, как в примере 6) и отбирают фракции со скоростью 250 мл/мин. Две первые 2О-литровые фракции отбирают и. отбрасывают. Отбрасывают также головную фракцию объемом 10 л Затем собирают 30 богатых фракций объемом 2 л. Фракции 1-13./И 2.5-30 отбрасывают. Фракции 14-16 объединяют. Они сс5держат 80 г преимус естченНр С-076 Й1в. Фракции 22-24 объединяют. Они содержат 6,7 г преимущественно С-076 Харсжтеристики м .В1в. Фракции 17-21 содержат смесь С-076 В1а и В1в Фракции 17-21 объединяют, концентрируют и пропускают через колонку, заполненную Сефадексом ЛН-20, пользуясь тем же растворителем. Три первых фракции по 20 л отбрасывают. Затем отбирают следующие богатые фракции: 5 фракций по 2.л (фракции 1-5) 20 фракций по 1 л (фракции 6-25) и 10 фракций по 2 л (фракции 26-35) ..Фракции 1-5 отбрасывают. Фракции 16-21 содержат 13,5 г C-G76 В1в и 0,4 г С-076 В2в, фракции 22-26 содержат 44 г С-076 В1а и 0,13 В1в, фракции 27-30 содержат 10,2 г В1в и 0,8 С-076 В1в. Отделение компонентов в от компонентов а производят с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. 30 мкл смеси С-076 В1а и А1в В абсолютном метаноле, содержащей 30 мкл С-076 А1в загружают в колонку для жидкостной хроматографии высокого давления, содержащую Сфери-Сорб 5 мкм ОД8 ( Спектра Физике) в качестве насадки. Колонку элюируют смесью метанол:вода 85:15 со скоростью 15 мл/мин. Элюирование контролируют по УФ- поглощению элюата и индивидуальные компоненты собирают на выходе из УФ-прибора. Извлекают 30 мкг С-076 и анализируют в массспектрометре. Масс-спектр этого образца приведен во второй колонке абл.3. В табл.4 и 5 приводится антипаразитарная активность полученных соеинений. ектральных пмков Т а б л и ц а

Вид организма Обработкуне произво70 .442- 1421 дили 1.-676, 895, )( -ООР07 9698 95 «(j « 9699 94 - л 9696 t-676, 90 0 L-676, 8970060487 0-71 0,05 3 o,025 3 90085

59

73

0,1

Продолжение табл.3

100

«

IOC

18

72

69 1137;. 2852 -4110. .193 1761. .61 )((«-«ifjljivtf-X lf 9899999794 99 99 93 4986 j,), . 9999999895 99 999335 к X titiKf, 9999 999294 С-076 А2 i--676, 89396 99 9 -00X03-.0,1 3 0,05 3 83 88 .14 0,025 3 46 1 72 1 кл -Снижение количества образцом, вызванное

Аитипаразитарная активность С-076 при нслытаяии на искусственно зараженном крупном рогатом скоте

Вид организма

ф -Значительное снижение эффективности по сравнению с эффективностью при овравотке други1«1 соедииеиням С-76, .

& -Наружное применение.

Таблица 5 99 , 36 87 46 46 53 О 69 11 5 23 О паразитов по сравнению с контрольным обработкой ,05,,01 0,001 соответственно .

Формула изобретения

и неорганические соли в аэробных

условиях с последуюищм выделением

из среды выращивания целевого продукта.

4,Способ ПОП.1, отличающийся тем, что целевой продукт выделяют путем фильтрования среды выращивания с последующим экстрагированием образовавшегося на фильтре остатка мицелия смешивающимися с водой органическими растворителями, выпариванием органического растворителя и экстрагированием остатка на смешивающимся с водой органическим растворителем.