Способ получения 7 (д-5-амино-5-карбоксивалерамидо (-3-) -метокси-псульфооксициннамоилоксиметил)7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты и 7 -(д-5-амино-5карбоксивалерамидо (-3-) метокси-п-оксициннамоилоксиметил) -7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты Советский патент 1976 года по МПК C12P35/08 A61K31/545 C12P35/08 C12R1/545 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-р-{0-5-АМИНО-5КАРБОКСИВАЛЕРАМИДО)-3-(а-МЕТОКСИ-пСУЛЬФООКСИЦИННАМОИЛОКСИМЕТИЛ)-7-МЕТОКСИ-3Ц,ЕФЕМ-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ И 7-р-(О-5-АМИНО-5КАРБОКСИВАЛЕРАМИДО)-3-(а-МЕТОКСИ-п-ОКСИЦИННАМОИЛОКСИМЕТИЛ)-7-МЕТОКСИ-3-ЦЕФЕМ-4-КАРБОНОВОЙ

КИСЛОТЫ центре и сильнее по краям. Растворимый пигмент светлый, рыжевато-желтый. Агар из яичного белка. Субстрактный мицелий серовато-рыжевато-коричневый. Воздушный мицелий рыжевато-коричнево-желтый с зеленоватым оттенком, край коркчнево-рыжевато-желтый, рост слабый в центре и сильнее ПО краям. Раствори1мый пигмент светлый рыжевато-желтый. Желатиновый косой агар. Рос в виде осадка на дне сосуда, слоистый, окрашенный в кремовый цвет. Питательный желатиновый агар вегетативный мицелий кремовый. Воздушный мицелий бледный, .рыжевато-желтый. Растворимого пигмента «ет, сжижение желатина хорошее. Лакмусовое молоко. Неполное кольцо. Вегетативный мицелий коричневатый. Воздушный -мицелий мягкий, беловатый. Снятое молоко. Неполное кольцо. Вегетативный мицелий коричневый. Воздушного мицелия нет. Растворимый пигмент светло-коричневый. Крахмальный агаровый косяк. Вегетативный мицелий кремовый. Воздушный мицелий палевый. Растворимого пигмента пет. Хороший гидролиз. Картофельная масса. Вегетативный мицелий светло-желтый. Воздушный мицелий средний. Слабое потемиение картофеля. Агар яблочно-кислого кальция. Вегетативный мицелий плоский полупрозрачный и бесцветный по краям темный и кремово-окрашенный в центре. Воздушный мицелий от кремового до желтого. Края рыжеватожелтые. Растворимого пигмента нет. Тирозиновый агаровый косяк. Вегетативный мицелий кремовый. Воздушный мицелий желтовато-рыжий с зеленоватым оттелкоМ, края рыжевато-желтые. Растворимый пигмент очень светло-коричневый. Агар пептонно-железо-дрожжевого экстракта. Вегетативный мицелий кремовый. Воздушного мицелия нет. Растворимого пигмента нет. Сероводород не образует. Хорошо усваивает глюкозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннозу, маннит, лактозу; плохо усваивает: мнозит, сахарозу, рамнозу, рафинозу; ие усваивает: фруктозу и целлюлозу. Кроме вышеуказанной культуры (МА-2837), были идентифицированы дополнительно двадцать пять культур как продуценты антибиотика. Они включают: три Культ фы вида Streptomyces griseus, одиннадцать культур Streptomyces viridochromogenes, пять культур Steptomyces fimbriatus, три культуры Str. halstedii, одну культуру Streptomyces rochei, одну культуру Streptomyces cinnamaneusis и одну культуру Streptomyces chartreneusis. Эти штампы рода Streptomyces идентифицируются как культуры МА-4160, МА-4174, МА-4171, МА-4177, МА-4178, МА-4180, МА64,МА-4165, МА-4166, МА-4167, МА-2892, -3265, МА-4162, МА-4163, МА-4159, МА69, МА-4170, Л1А-4179, МА-4161, МА-4168, -4175, МА-4181, МА-2938, МА-4176 и МА73 в коллекции культур фирмы Me ск и Со., c. Rahway Нью-Джерси. Эти культуры пош,ены на постоянное хранение с коллекцией льтур Northeru Utilization Research and velopment Brauch of theU. S. департамента ьского хозяйства США в Peoria, Иллинойс. льтурам присвоены следующие номера Streptomyces griseus МА-4160NRRL3951 МА-4174NRRL3953 МА-4171NRRL3952 Streptomyces viridochromogenes МА-4177 NRRL3970 МА-4178MRRL3971 МА-4180NRRL3972 МА-4164NRRL3966 .МА-4165NRRL3967 .MA-4166NRRL3968 МА-4167NRRL3969 МА-2892NRRL3962 МА-3265NRRL3963 МА-4162NRRL3964 МА-4163NRRL3965 Streptomyces fimbriatus MA-4159 NRRL3954 MA-4169NRRL3956 MA-4170KRRL3957 MA-4179NRRL3958 MA-4161NRRL3955 Sireptomyces halstedii MA-4168 NRRL3959 MA-4175NRRL3960 MA-4181NRRL3961 Streptomyces rochei MA-2938NRRL3973 Streptomyces cinnamoneusis MA-4176NRRL3974 Streptomyces chartreusis MA-4173 NRRL3975 ример 1. ультуру Str. griseus выращивают на среде, ющей следующий состав: реда 1: Difco дрожжевой экстракт10,0 г Глюкоза 10,0 г Фосфатный буффер2,0 мл MgSO4-7 Нгб 0,05 г Дистиллированная вода1000,0 мл Difco агар25,0 г Фосфатный буффер: КН2Р0491,0 г NasHPO95,0 г Дистиллированная вода1000,0 мл осой агар готовят путем разливания среды мл в пробирки. Пробирки затем закрываватными пробками и стерилизуют при тематуре 120°С в течение 15 мин, так что среастывает в наклонном положении. Инокулированкый скошенный агар выдерживают при 28°С в течение одной недели и затем хра нят при температуре 4°С до использования Культуру на одном из этих агаров используют для инокуляции в колбах Эрленмейера (250 мл), содержащих 50 мл среды II. В про бирки добавляют 5 мл стерильпой среды, со скабливают с поверхности агара культуру и осторожно прикапывают по 1 мл культуры в каждую из трех колб. Среда II имеет следующий состав, г: Мясной экстракт3,0 NZ амин (ферментативный гидролизат казеина)10,0 Декстроза10,0 NaCl5,0 Дистиллированная вода1000,0 рН нейтрализуется до 7,2 с помощьюNaOH Засеянные пробирки встряхивают с помощью ротационной качалки со скоростью 220 об/мин в течение трех дней. Затем пробирки с культурой используют для инокуляции в колбах Эрленмейера емкостью 2 л, каждая для которых содержит 350 мл среды III причем используется 2-3%-ная культура Среда III имеет следующий состав, г: Декстроза10,0 Аспарагин1,0 К2НРО40,1 MgSO4-7H2O0,5 Дрожжевой экстракт0,5 Индикатор элементов смеси № 210,0 мл Дистиллированная вода1000,0 мл Состав индикатора элементов смеси № 2: FeSO4-7H201,0 г MnS04-H2O1,0 г CuCl2-2H2O25,0 мг СаСи100,0 мг НзВОз56,0 мг (ЫН4)бМо7О24-4Н2019,0 мг ZnSO4-7H20200,0 мг Дистиллированная вода1000,0 мг рН доводят до 7,2 с помощью раствораNaOH Пробирки встряхивают с помощью качалки со скоростью 135-150 об/мип в течение 4 дней при температуре 28°С. В конце инкубационпого периода содержимое одиннадцати пробирок сливают и исследуют. Смещанный, полученный в результате центрифугирования бульон, имеет защитную зону против Proteus Vulgaris, равную 22 мл при исследовании на чащках Петри с дисками. Эта смесь антибиотика включает 7|5-О-5-амино-5-карбоксивалерамидо-)-3-(а - метокси -/г - сульфооксициннамоилоксиметил) - 7-метокси-3-цефем-4-карбоновую кислоту и 7р-(В-5-амино-5-карбоксивалерамидо-)-3-(а-метокси - п - оксициннамоилоксиметил)-7-метокси-3-цефем - 4-карбоновую кислоту (1 а). Этап 1. Содержимое лиофилизированного туба (МА-2837) суспендируют в 2 мл среды 1/ом., пример, 1), и образующийся инокулум лиофялизированной культурой МА-2857 инокулируют скощенный агар средыКЬ 1 (см. пример 1). Эти скосы инкубируют при 28°С в течение 5 дней или до образования спор, а затем 10 мл среды VIII добавляют к скосам. Среда VIII, состав, %: Мясной экстракт0,3 NaCl0,5 NZ Амин1,0 Декстроза1,0 рН7,0 Культуру на каждом агаре соскабливают и полученную суспензию используют в качестве инокулама на этапе 2. Этап 2. Суспензию, полученную на этапе 1, используют для инокулирования колбы Эрленмейера, в которой содержится 50 мл стерилизованной среды VIII (см. этап 1). Ииокулированную колбу помещают на 48 ч при 28°С в роторную качалку (220 об/мин). ЭтацЗ. Содержимое инокулированной колбы из этапа 2 используют для инокулирования двухлитровой колбы Эрлецмейера, содержащей 500 мл среды VIII (см. этап 1). Инок яироваЦную колбу помещают на 48 ч при 28°С в роторную качалку (220 об/мин). Этап 4. Полученный на этапе 3 инокулум используют для инокулирования ферментатора из нержавеющей стали емкостью 757 л, в котором находится 467 л стерильной среды VIII. Ферментация проводится при температуре 28°СприперемещИванИИ (130 об/мин) в течение 65 ч при одновременной продувке воздуха. Во время ферментации используют в небольщом количестве пеногаситель-полигликоль 200. Этап 5. 378 л полученного ца этапе 4 инокулума используют для инокулирования 4542 л среды IX, находящейся в ферментаторе из нержавеющей стали емкостью 5680 л. Среда IX, состав, %: Жидкость для замачивания зерна4,0 Декстроза2,0 рН доводят до 7,2 с помощьюNaOHФерментацию проводят при температуре 28°С и перемещивании (1200 об/мин), пропуская через аппарат воздух в течение 30-36 ч. В качестве пеногасящего агента используют небольщие количества полигликоля 200. Бульон собирают и определяют его активность с помощью дисков чашек Петри, получают защитную зону против Proteus vulgaris МВ-838. равную 32,5 мм при возрасте культуры в 31 ч. Выделение антибиотика. Отфильтрованную культурную жидкость

(40688 л), лолзченнзю на стадии А этап 5, собирают после 36 ч и рН доводят 7-8 до 3,0 в ферментаторе путем добавления фосфорной кислоты. При пропускании культуральной жидкости через фильтр-пресс пластинчатого типа удаляют мицелий. Отфильтрованный бульон затем пропускают через фильтрующий слой адсорбирующей смолы (Амберлит ХАД2) объемом 378,5 л со скоростью 37,85 л/мин. Отработанный бульон подвергают исследованию и сбрасывают, а фильтрующий слой смолы промывают двумя объемами воды. Антибиотик вымывают из фильтрующего слоя смолы с помощью 60%-ного раствора метанола в воде, расход раствора равен 19 л/мин. Сорок фракций, каждая по 19 л, собирают и исследуют.

Фракции 2-10 объединяют и удаляют метаяол путем вакуумного упаривания. рН конечного концентрата (157 л) доводят до 3,5 добавлением гидроокиси аммония и держат в охлажденном виде.

Образцы подвергают биоиспытаниям против Proteus vulgaris обычным методом с использованием дисковых чашек Петри. Отработанный бульон и промывка:

10 фракций по 378,5 л показали отсутствие защитных зон без разба.вления, так же, как п промывочная вода.

Общий вес твердого исследованного протукта:

Отфильтрованный

бзльон119 кг

738 л объединенного

элюата7,23 кг

157 л .концентрированного элюата7,2 кг

Полученный концентрат (78,5 л) разбавляют подои до 117 л и адсорбируют на фильтрующем слое объемом 22,5 л, состоящем из слабоосновной анионообменной смолы. (Амберлит IPA-68 смола на хлорндном кольце) при рН 4 и расходе равном 2 галлона/мин. Затем фильтрующий слой промывают 45 л промывочной воды, а затем элюируют раствором 1 N нитрата натрия и 0,1 М ацетата натрия при рН 7,5 и расходе равном 1,5 л/мин. Собирают 10 фракций элюата по 18,9 л и доводят рН до 4 с яомощью соляной кислоты.

Все фракции подвергают биоиспытаниям стандартным методом с помощью дисков чащек Петри против Proteus vulgaris. Полученные фракции 1 -10 объединяют н адсорбируют на адсорбирующей смоле Амберлит ХАД-2, образзющей фильтрзющий слой объемом 45 л (при рН 3 и расходе 5 л/мин). Фильтрующий слой промывают 90 л воды с тем же расходом. Антибиотик затем элюируется из смолы 25%-ным водным раствором ацетона при расходе 5 л/мин. Собирают 16 фракций по 18,9 л.

Все фракции подвергаются биоиспытаниям обычным методом против Proteus vulgaris. При исследова-чин питательного раствора (190л).- - ,: . .

Фракции злюата 2-16 объединяют и в вакууме выпаривают ацетон, получая в конечном итоге 17,4л концентрата, затем с помощью гидроокиси аммония рН концентрата доводят до 4 и при последующей сущке заморажнванием получают 620 г антибиотика 810А, .представляющего собой смесь, состоящую из 7)3(О-5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(а - метокси-« - сульфооксициннамоилоксиметил) - 7метокси-З-цефем-4-карбоновой кислоты н (О-5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3 - (а-мето.кси-/г - оксициннамоилоксИМетил)-7 - метокси-3-цефем-4-:карбоновой кислоты. Полученный сухой продукт прн концентрации 300 мкг/ мл дает 25 мм на защитную зону.

Хроматографическую колонку занолняют фильтрующим слоем высотой 100 см, состоящим из анионообменной смолы ДЕАЕ Сефадеко А-25. Антибиотик 81ОА (10 г) растворяют в 18 мл раствора, состоящего из 0,5 молей

бромистого аммония и 0,05 молей уксусной кислоты и заполняют этой смесью колонку. Затем через фильтрующий слой прокачивают элюирующий раствор с расходом 81 ммолей/ч и отбирают фракции элюата по 10 мл. Элюат

исследуют с помощ.ью дифференциального рефрактометра, который зарегестрировал пики массы в трубках 19, 36, 79, 109 и 206. Каждую третью фракцию исследуют.против, Proteus vulgaris (МВ-838) с использованием 0,5-дюймовых дисков при рП 7.

Проводят повторное исследование и фракции 82-130 и 180-234 объединяют.

Фракции, содержащие первый активный компонент из двух выщеприведенных онытов

объединяют и адсорбируют на фильтрующем слое 100 мл смолы Амберлит ХАД-2. Фильтрующий слой промывают одним объемом воды и элюируют затем тремя объемами 90%ного водного раствора метанола. Метанол

упаривают в вакузме и водный концентрат нодвергают сушке замораживанием, получая 810 мг продукта, представляющего из себя 7(3-0-5-амино-5-карбоксивалерамидо) - 3-(аметокси-« - оксициннамоилоксиметил)-7 - метокси-З-цефем-4-карбоновую кислоту. Биологическая а.ктивность этого продукта, определенная с помощью дисков против Proteus vulgaris при концентрации 18 мкг/мл составила 25 мм (диаметр защитной зоны). Анализ

на ультрафиолетовое поглощение дал следующие результаты:

Уф-поглощение в 0,1 н. НС1 Лмакс- 305

0,1 н. NaOH К,

328

мако.

Фракции, полученные -в двух сериях опытов на Сефадекс-А-25, содержащие второй активный компонент, объединяют н адсорбируют на 100 мл фильтруютцего слоя смолы Амберлит ХАД-2. Фильтрующий слой промывают одним объемо.м воды и затем элюаты объединяют, а метанол отгоняют, упаривая его в вакууме. Водный концентрат высушивают замораживанием и получают 720 мг7-|3-(В-5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(а - метокси-п-сульфооксициннамоилоксиметил)- - метокси-3-цефем4-карбоновой кислоты (1с). Анализ на ультрафиолетовое поглощение дал следующие результаты:

УФ-поглощение в 0,1 н. НС1 Кмакс 287 мм 432

УФ-иоглощение в 0,1 н. NaOH 280 мм Е-„ 432

Формула изобретения

1. Способ получения 7-р-(0-5-амино-5-карбоксивалерамидо-)-3(а-метокси-п - сульфооксициниамоилоксиметил)-7 - метокси-3 - цефем4-карбоновой кислоты и 7р-(В-5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(а-метокси - п - оксициннамоилоксиметил)-7-метокси-З - цефем-4-карбоновой кислоты, отличающийся тем, что культуру-продуцент из группы актиномицетов, например Streptomyces griseus МА2837, выращивают в аэробных условиях па среде, содержащей исгочники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта ,из фильтрата культуральной жидкости известными приемами.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что выращивание осуществляют па среде, содержащей 1-6% углевода и 0,2-6,0% ассимилируемого азота.

3.Способ по пп. 1-2, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что выращивапие осуществляют при 20- 37°С и рН 5,5-8,0.