Способ выделения микроорганизмов,обладающих полиредуктазными свойствами,из природных субстратов Советский патент 1986 года по МПК C12N1/00 C12Q1/00 C12N1/00 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии.

Цель изобретения - сокращение времени выделения микроорганизмов- полиредуктантов.

Сущность способа заключ ается в следующем. Исследуемую пробу высевают в 3-5 параллелыгых рядов пробирок, которые затем доверху заливают средой накопления (среда Штурм) и закрывают резиновьми пробками. Среда накопления имеет следукящий состав дистиллировашюй воды., г/л:

3,5

1,0

0,5 1,0 0,5 0,5

1 мл

Через 10-14 дней инкубации при ,28 С, когда визуально наблюдают по- -1ернение среды, свидетельсм-взлощее о наличии процесса сульфатредукции, производят посев среды из накопительной культуры в чашки Петри на по- верхность рыбопептонного агара (РПА/

в 10-20 кратной повторности. Г

Все выросшие на РПА колонии выделяют в чистой культуре на скошенный РПА и затем пров еряют их способность к восстановлению нитратов и сульфатов. Суспензию чистых культур высевают в среду для выращивания факультативно-анаэробных денитр1 ици- рующих микроорганизмов (среда Гнпь- тая) следующег о состава дистиллированной воды, г/л:

ий

0,5

10,0

2,0

2,5

2,0 2,0 0,2

Следы 0,1%

Изменение окраски среды от зепено- ватой до синей через неделю инкубации, происходящее при подщелачива- I

НИИ среды и появление иона N0,- ( о чем судят по порпзовению среды при добавлении реактива Грисса), свидетельствует о наличии процессе денит- рификации.

С колонии на РПА делают также посев на агаризованную среду для суль- фатредуцирующих микроорганизмов {среду Штурм) следующего состава дистиллированной воды, г/л:

0

Лактат кальция Сернокислый аммоний

Фосфат калия, однозамещенньш Сульфат магния Сульфат кальция Соль Мора 1 раствор сульфида натрия Агар :

3,5 1,0

0,5 0,5 0,5 0,5

1 мл

15-20

О развитии процесса сульфатредукции /судят по образованию черных , колоний в толще агаризованной среды.

Наличие роста на всех предлагаемых средах с образованием соответствующих восстановленньгх продуктов (нитрит-иона, газообразного азота, сероводорода) указывает на возможность проявления выделенными культурами микроорганизмов полиредзгктаз- ных свойств, С отобранными таким образом штаммами микроорганизмов проводят ряд. 5-10 кратных перекрестных пе- t ресевов на указанные среда в соответствии со схемой.

Способность чистых культур роорганизмов развиваться на всех предлагаемых- средах в течение ряда перекрестных пересевов и осуществлять на соответствующих средах восстановление кислорода, нитратов или сульфатов указывает, что выделенный штамм обладает полиредуктазными свой- ствами.

Способ поясняется конкретным - примером.

Пример. Из почвы и шахтных вод месторождения стерильно отбирают пробы, каждую из которых затем .высевают в 5 пробирок с жидкой срег. дои Штурм дпя получения накопительной культуры в анаэробных условиях. Количество инокулята составляет 5-- 10% от общего объема питательной среды.

Пробирки закрывают резиновыми . пробками так, чтобы в пробирке не осталось пузырьков Воздуха и инкубируют в термостате при 28°С. Через 10 дней, если в пробирке наблюдает- ся почернение среды, обусловленное развитием микроорганизмов, восстанавливающих сульфаты с образованием сероводорода, из полученной накопительной культуры делают высев на ры- бопептонный агар в 5-10 чашек Петри и культивирование ведут в аэробных условиях .в течение трех суток. В этих условиях происходит гибель всех олигатно-анаэробных микроорганизмов, в частности сульфатредуцируюпшх бактерий. На чашках Петри обычно вырастает небольшое количество колоний, которые выделяют в чистой культуре на скошенньш рыбопептонный агар- Чистые культуры микроорганизмов высевают в 5 пробирок со средой Гиль- тая для проверки их денитрифицирующей способности и в 5 пробирок в анаэробные условия :-на агаризованнук) среду Штурм.

Через 10.дней наличие роста в анаэробных условиях, появление серо- водорода на среде Штурм, а также обнаружение нитритов в среде Гильтая свидетельствует о выделении микроорганизмов - полиредуктантов, В качестве контроля используют среды, не засеянные микроорганизмами.

Исследование 50 образцов воды, почвы и руды позволило вьщелить 4 штамма микроорганизмов, обладающих полиредуктазными свойствами.

Выделенные культуры микроорганиз- мов были идентифицированы по определению Берги как аэробные формы, относящиеся к семейству Pseudompna daceae роду Pseudoinonas и видам PS. stutzeri и PS. mendocina. Так ка культуры отличались от описанных в определителях Берги и Скермана рядом новых свойств, в частности способностью редуцировать сульфаты, к ви- дивому названию культуры было добав- лено название варианта var. desul- furicani-.

Выделенные микроорганизмы отличались некоторыми культурально-морфо- логическими свойствами и поэтому были разделены на две группы, в одну из которых вошли штаммы 18 и 126-4, а во вторую - 28 и 39в-4.

Описание изученных культур микроорганизмов: Pseudomonas stutzeri var. desulfuricans 8 - грамотрицательная, подвижная, неспорообраззлощая палочка, размеры которой 2 0,5-0,7 мкм. На РПА колонии вырастают округлой формы, диаметром 5-6 мм коричневого цвета, блестящие, гладкие. Имеют один жгутик. Оптимальное значение рН в пределах 7,2-8,5. Температурный оп- 25-30 С, но может расти и при 42°С. При роста нет. На мясопеп-. тонном бульоне образует скудный осадок, слабо выделяет Nrf . и Н S. Протеолитической способностью не обладает, гидролизует крахмал, молоко не пептонизирует и не гидролизует. Оксидазоположительна. Хемоорганотроф - на. Способна расти аэробно на рыбо- пептонном агаре. В качестве источника азота в аэробных условиях используют мочевину, пептон, аспарагин. В качестве единственного источника углерода.в аэробных условиях использует глюкозу, фруктозу, ксилозу, арабинозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, декстрозу, глицерин, сорбит, маннит, этанол. Микроаэрофил при росте в аэробных условиях развивается в присутствии органических субстратов, снижающих ОВП среды - мочевины, сульфида натрия.

В анаэробных условиях в качестве энергетического субстрата использует лактат, пируват, ацетат, глюкозу. В присутствии переменновалентSv

ных элементов (N0,, Fe , As SO ) растет на глюкозе, ацетате, лактате, пирувате. В отсутствии ионов N0.,, As, Fe - на лактате, пирувате, ацетате. Без ионов SOv - рост не наблюдается.

Способна восстанавливать 0,85- 0,94 мг/мл нитратов до 120 мг/мл сульфатов. Не может осуществлять брожение с образованием газообразных продуктов в анаэробных условиях в присутствии гхаокозы. Содержание Г+Ц в ДНК 62,5 мол.%. Десульфовиридин не обнаружен. Выделен из шахтных вод Бакырчикского месторождения.

Pseudomonas stutzeri var. desulfuricans 126-4 по большинству показателей въщеленньм штакм сходен с описанным вьш1е Ps. stutzeri var. desulfuricans 18. Отличительными являются следуюш 1е свойства: штамм 126-4 имеет размеры 1,5x0,4-0,6 мкм.

В качестве единственного источника углерода не использует глицерин, декстрозу, сорбит и этанол. Выделен из лечебной грязи озера Балпаш-Сор.

Pseudomonas mendocina var. desuT- furicans 28 - грамположительная, не- спорообразующая палочка, имеющая размеры 1x0,4-0,5 мкм. На рыбопептон ном агаре колонии вырастают беловатые, гладкие, блестящие, округлой формы. Оптимальное значение рН в пределах 7,2-8,5, температурный оптимум 25-30°С, но может расти и при . При роста нет. На мясо- пептонном бульоне образует плотный обильный осадок, вьоделяет NH и , протеолитической способностью не об- Надает. гидролизует крахмал. Расщепляет жиры, свертывает молоко. Ок- сИдазаотрицательна. Хемоорганотрофна Способна р&сти аэробно на рыбопеп- тоином агаре. В качестве источника азота в аэробных условиях использует мочевину, пептон, аспарагин. В качестве единственного источника угле- рода в аэробных условиях использует арабинозу, гЛюкозу, ксилозу, р амнозу фруктозу, галактозу, сахарозу, лактозу, рафинозу, декстрозу, глицерин, сорбит,маннит. При росте в аэробных условиях развивается в присутствии органических субстратов, снижающих ОВП среды мочевины, пептона, сульфида натрия.

В анаэробных условиях в качестве энергетического субстрата использует лактат, пируват, глюкозу, ацетат. Независимо от присутствия в

среде ионов переменновалентных металлов (NOj , As , Fe . SO ) хоРедактор Ю.Середа

Составитель В.Голимбет

Техред И.Поповигч Корректор М.Максимишинец

Заказ 4686/28 Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприяите, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

рошо растет в анаэробных условиях яя глюкозе, пирувате, ацетате.

Способна восстанавливать 0,87- 0,9 i мг/мл нитратов и до 30 мг/л . сульфатов. В среде с глюкозой в анаэробных условиях осуществляет брожение с образованием газообразных продуктов. Содержание Г+Ц в ДНК 51,7 51,7 мол.%. Десульфовиридин не обнаружен. Выделен из щахтных вод Бакыр- чикского месторождения Pseudomonas mendocina var. desulfuricans 39 в-А- по большинству признаков вьщеленная культура микроорганизмов также сходна с PS. mendocina var. desulfuricans 28. Но имеются следующие отли- . чительные признаки. Штамм 39в-4 име- ет размеры клеток 1 « 0,3-0,4 мкм. В . качестве единственного источника углерода использует мальтозу, дуль- цит и глицерин. Штамм 39в-4 обладает слабой протеолитической активностью и слабо разжижает желатин.

Вьщелен из воды канала Иртыш- Караганда.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выделить в течение 25-30 дней представителей новой группы микроорганизмов, способных в анаэробных условиях восстанавливать ряд переменно валентных тов и расти в аэробных условиях, в то время как, используя общепринятые методы, поиск микроорганизмов - полиредуктактов по проверке всех выросших на РИА колоний микроорганизмов к способности к полире дукции, может занять неопределенно долгое время.