Способ выделения иммунодепрессора из тканей млекопитающих Советский патент 1986 года по МПК A61K35/00 A61K35/12 

I

Изобретение относится-к фармацев- тической промьппленности и касается получения биологически активных веществ, обпадаюш фармакологическим действием.

Целью Изобретения является упро- П1;ение способа получения иммунодепрес сора из животного сырья.

Способ осуществляют следующим обра з.ом.

Исходное сырье (печень, селезенка, тимус, сыворотка крови) гомогенизируют в физиологическом растворе, центрифугируют и супернатант нагревают до 65-80 С для удаления термола- бильньк белков. Просветленный фильт- рочанием раствор высаливают сульфатом аммония при 60-80% насыщения, преципитат растворяю г в воде и обезвоживают ацетоном. Полученный на этом этапе норошок-сырец можно хранить продолжительное время при (+) - (+15)°С. I

На следующем этапе порошок-сырец растворяют и очищают методом ионно- обменной хроматографии.

Пример, кг печени быка гомогенизируют в 2000 мл физиологического раствора, центрифугируют при lOOOg 15 мин при . Полученный супернатант при перемешивании нагревают до 75°С5 охлаждают до и денатурированные белки отделяют фильтрованием, К фильтрату добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 50%-ного насыщения и выдержи-. вают на холоде 1 ч. Далее центрифугированием при lOOOg 20 мин удаляют образовавшийся осадок, а к супер- натанту вновь добавляют сульфат аммо кия до 75%-ного насыщения и оставляют на холоде 1 ч. Образовавшийся преципитат собирают центрифугированием, растворяют в 300 мл воды и смешивают с 10 объемами охлажденного до -15°С ацетона. Через ч обрг1- зо вавшийся пре1щпитат отделяют от растворителя фильтрованием под ва- куумоы. Осадок промывают на фильтре в 500 мл охлажденного ацетона. Получают 1,8 г сухого порошка кремо- .вого цвета. Содержание белка (по Лоу ри) 86%, Методом электрофореза на бумаге при стандартных условиях разделения белков сыворотки крови определяют состав образца. Препарат содержит 5% г альбумин 42,7; альфа- - . rno6yHtJH 8,5f альфа 2-глобулин 10,6

437302

14,8% бела-глобулин 14,8; гамма-глобулин 23,4.

На втором этапе 300 мг препарата (порошка-сырца) растворяют в 20 мл

5 0,,01М фосфатного буфера, рН 8,15. Полученный раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, предварительно уравновешенной тем же буфером. Размер колонки 20x1,5 см. Колонку про мывают 0,2м фосфатным буфером,

рН 8j, 15, затем 1М раствором NaCi и затем активную фракцию элюируют OjlH.NaOH. Выход белков регистрируют на проточном денситометре.

5 Активную фракцию обессоливают на колонке с сефадексом G-25 и при необходимости лиофильно высушивают. Испытание биологической активности пр епарата проводят методом кального гемолиза в геле на модели первичного иммунного ответа животных. ,Цпя этого мьшгам линии СВА вводят исследуемый препарат внутрибрю- шинно в физиологическом растворе

-5 за сутки до иммунизации. В качестве антиг ена используют 5%-ную взвесь эритроцитов барана. Контрольная группа животных получает объем физиолоческого раствора. На 5-е сут30 ки животных забивают, извлекают селезенки и готовят из них взвесь клеток .

Взвесь клеток от каждой мыши помещают в отдельную пробирку и добав35 ляют туда эритроциты барана до конечной концентрации 5% и 1%-ный раствор агара, приготовленного на солевом растворе Хэнкса и нагретого до 48 С, Содержимое пробирки аеремеши 0 вают и равномерно распределяют по

поверхности чашки Петри. После застывания агаровой смеси чашки переносят в термостат на 1,5 ч. Далее в каждую чаишу добавляют по 2 мл комплемента

ЯР

- морской свинки, разведенного в

10 раз физиологическим раствором, и снова инкубируют в термостате 40 мин. Затем чашки извлекают и подсчитывают зонь лизиса на их поверхности.

50 Первая зона лизиса образуется одной антителообразующей клеткой (АОК), Общее число антителообразугощих клеток в селезенке к-аждой мьшJИ подсчитывается с учетом разведения клеточ55 ной взвеси. Например, селезенку мьши гомогенизировали в 2 мл физиологического раствора и в omiT взяли О, 1 мл, т.е. 1/20 ч. Следовательно, число

3.1243730 .4

зон лизиса на чашке Петри необходи- Результаты нммунодепрессивной ак- мо умножить на 20. Полученные данные тивности образцов пр-иввдены в табли- обрабатьшают статистически.це.

Конт- Физиологичес- 0,5 мл роль кий раствор

пыт 1 Сырец

пыт 2 Препарат

после

i ионнообмен- ной хроматографии

: 2 мг в

0,5 мл физиологическогораствора

0,008 мг в 0,5 мл физиологического раствора

Примечание: ЯСК - число ядросодержащих клеток

в селезенке, подсчитывается в камере Горяева.

35

В предложенном способе сокращение временных и трудовых затрат обусловлено применением низкоскоростного центрифугирования, что. позволяет использовать роторы с большим рабочим объемом и меньшим временем разгона и остановки, а также отсуствием длительного процесса диализа и возможностью накопления больших количеств

40

промежуточного продукта-сы в свою очередь позволяет п хроматографические колонки емкостью и приводит к сокр дозатрат при очистке препа кроме того, заменой гельфи на ионнообменную хроматогр дающую большей емкостью и разделения.

Редактор М. Келемеш

Составитель Л.Шилина Техред М.Моргентал

3735/5

Тираж 660Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород ул.Проектная, 4

41500+ 108+7

+2400.

8000+ 103+8 +210

87±9

4500± 98+11 + 1700

промежуточного продукта-сырца, что в свою очередь позволяет применять хроматографические колонки большей емкостью и приводит к сокращению трудозатрат при очистке препарата, и кроме того, заменой гельфильтрации на ионнообменную хроматографию, обладающую большей емкостью и скоростью разделения.

Корректор М.Максимишинец