Способ определения фибринолитической активности Советский патент 1986 года по МПК C12N9/68 

Изобретение относится к медицине в частности к энзимологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа за счет проведения определений при рН l,8-8j5, остановки реакции раствором щелочи и применения в качестве субстрата измельченного фибрина.

Способ осуществляют следующим образом,

К суспензии фибрина (субстрата), модифицированного п-диазобензолсуль фокислотой, с содержанием 20-30% групп формулы

- -/оУ- 5 1 а

в буферном растворе с рН i,8-8,5 прибавляют аликвоту исследуемого ферментсодержащего раствора, инкубируют смесь при 37 С в течение 20- 120 мин (в зависимости от интенсивности развивающейся окраски), останавливают реакцию, добавляют раствор 0,1 М едкого натра, фильтруют через бумажный или ватный фильтр и определяют оптическую плотность фильтрат при 440 нм. Контролем служит суспензия субстрата, к которой сначала до- бавляют раствор едкого натра, а затем аликвоту исследуемого раствора. За единицу фибринолитической активности принимают то количество фермента (для плазмы - объем плаз- Nfti), которое в условиях определения за Т ч дает прирост оптической плотности, равный I.

Пример I, К суспензии 5 мг субстрата в I мл 0,05 М Na-фосфатно- го буфера, рН 7,4, содержащего

Редактор Н. Гунько

Составитель М. Позняк

Техред Л.Олейгаос .Корректор И. Эрдейи

Заказ 4787/29 Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5564t2

0,15 М NaC) , добавляют 0,2 мл раствора очищенного .плазминогена, активированного стрептокиназой (ШООО ед./мг плаэминогена), содер5 жащего 10 250мкг фермента. Смесь инкубируют ) ч при 37 С, затем добавляют 3 мл О, М раствора NaOH и фильтруют через бумажный фильтр. Удельная активность 3,0 ед./мг,

О Пример 2.К суспензии 5 мг субстрата в I мп 0,05 М трис-НС1 буфера, рН 8,5,, содержащего 0,15 М NaC}, прибавляют 0,2 мл раствора очищенной протеиназы из Thermoacty 5 nomyces vulgaris, содержащего 0,5 - 5 мкг фермента. Смесь инкубируют 20 мин при 37 С, затем добавляют 3 МП 0,1 М раствора NaOH и фильтруют через бумажный фильтр. Удельная

20 активность 1200 ед,/мг.

Пример 3. К суспензии 5 мг субстрата в 1 мл 0,1 М соляной кислоты, рН 1,8, содержащей 0,15 М

NaCJ, прибавляют 0,2 мп раствора

пепсина, содержащего 0,01 - 0,05 мкг фермента. Смесь инкубируют 30 мин при , затем добавляют 3 мп 0,1 М раствора NaOH и фильтруют через бумажный фильтр. Удельная активность 10600 ед./мг.

Предлагаемый способ позволяет определять фибринолитическую активность как очищенных ферментов, так и сложных биологических смесей в широком диапазоне значений рН - от рН l,8j где активны кислые протеиназы, до рН 8,5, где активны щелочные протеиназы, обладает вы- сокой чувствительностью, так как позволяет определять до 0,005 мкг фермента и по крайней мере вдвое превосходит известный способ по чув- .твительности,