Питательная среда для выделения и культивирования бифидобактерий Советский патент 1986 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

112

Изобретение относится к технической микробиологии, молочной промьгашенности, медицине и касается состава питательных сред для выделения, культивирования и количественного учета живых клеток бифидобактерий в молочных продуктах лечебного и диетического питания, фекалиях и других субстратах.

Цель изобретения - повышение качества среды за счет обеспечения стабильности ростовых свойств.

Оптимизация состава питательной среды по ростовым свойствам и активности, введение стимуляторов роста бифидобактерий и подбор компонентов питательной среды обеспечивает количество жизнеспособных клеток в 1 мл с сохранением исходных морфологических признаков и совокупности биологических свойств,

В табл, 1 приведены испытанные варианты предлагаемой питательной среды,

На полужидких средах с содержанием агара 0,075-0,2% при посеве 5% 16-часовой культуры B,adolescentis МС-42 наблюдается интенсивный рост через 16 ч культивирования при на средах 1 - 5, а на средах 2 и 6 наблюдается задержка роста бифидо бактерий - интенсивное помутнение среды происходит только к 24 ч, В среде 2 снижение массовой доли кукурузного экстракта до 0,3% и цистина до 0,05% тормозит интенсивность роста культуры, К таким же результатам приводит снижение пептона и лактозы до 0,7% в среде 6,

Повышение массовой доли пептона и.лактозы до 1,2% и цистина до 0,03% существенного влияния на ускорение роста бифидобактерий не оказывает и находится на уровне сред 3-5, Твердые среды с содержанием агра 1 ,8-2% позволяют получать характерный рост изолированных колоний бифидобактерий при выделении чистых культур,

При посевах чистых культур на полужидкую среду 3 и 4 с содержанием агара 0,1% в пробирках создаются достаточные условия для роста микробов по всему объему среды с наличием поверхностной стерильной зоны. Увеличение агара до 0,2% в среде 5 позволяет получать изолированные ко22

лонии в виде гвоздиков, легко .поддающиеся подсчету.

Натрий фосфорно-кислый двухзамещенный в количестве 0,05-0,1% и каЛИЙ фосфорно-кислый однозамещенный в количестве 0,15-0,2% обеспечивают стимуляцию роста бифидобактерий. Увеличение фосфорных солей в среде 3 ухудшает прозрачность среды, а уменьшение их в среде 2 ведет к снижению ростовых свойств среды. Добавление натрия лр монно-кислого трехзамещенного в количестве 0,5-0,8% позволяет поддерживать белки кукурузного

экстракта в растворенном состоянии, чем достигается необходимая прозрачность среды.

Проведенными испытаниями определяют оптимальные количественные соотношения компонентов среды.

Сочетание экстракта кукурузы с перечисленн1:1ми компонентами обеспечивает ростовую активность среды, не уступающую наиболее эффективным

партиям известной печеночно-цистино-вой среды. Оценку ростовых свойств среды проводят путем посева 16-часовой культуры бифидобактерий в количестве 5% и культивирования при

температуре , Результаты учитывают через 16-48 ч по наличию интенсивного роста культуры в зависимости от видовой принадлежности. Для посева используют шт.аммы В, bifidum

1 и В, adolescentis МС-42, Контролем служит печеночно-цистиновая среда Влаурока, Определение количества микроорганизмов в конце культивирования в 1 МП контрольной и испытуемой среды проводят путем посева

серийных разведений на печеночно-цистиновую среды Блаурока, Результаты учитывают через 72 ч культивирования ,

В табл, 2 приведены сравнительные

характеристики предлагаемой среды и печоночно-цистиновой среды Блаурока,

Данные, приведенные в табл, 2,

свидетельствуют о том, что предлагаемая среда не уступает по ростовой эффективности известной, так как количество жизнеспособных микробных клеток бифидобактерий, вырастающих на ней, не уступает их числу на лучших партиях печеночно-цистиновой среды. Это свидетельствует о достаточном содержании необходимых компо3нентов и их оптимальных количествен ных соотношениях в составе предлаг мой среды. Предлагаемая питательная среда о личается постоянством состава, что обеспечивает высокую воспроизводимость результатов по ростовой актив ности, обладает прозрачностью. Ее приготовление не требует тDvпoeмкиx подготовительных операций. Среда мо жет быть быстро приготовлена в лабо раторных условиях, В ней исключена необходимость использования животно го сырья пищевого назначения (говяжья печень) и дефицитного компонента - твина-80, ее стоимость вдвое н же стоимости известной среды, Предлагаемая питательная среда приготавливается следующим образот. Экстракт кукурузы разводят водопроводной водой в соотношении 1:6, фильтруют через ватно-марлевый филь и стерилизуют при давлении 0,05 МПа (112°С) в течение 30 мин. В емкость, содержащую 700-800 мл дистиллированной воды, вносят 9-10 пептона, 9-10 г лактозы, 30-60 мл предварительно разведенного в соотношении 1:6и простерилизованного экстракта кукурузы, 100-200 мг соля нокйслого L-цистина, 5-8 г лимонно кислого натрия трехзамещенного, 100 200 мг магния серно-кислого 7-водно го, 0,5-1,0 г натрия фосфорно-кислого двухзамещенного 12-водного, 1,5-2,0 г калия фосфорно-кислого од нозамещенного, 1,0-2,0 г агар-агара для жидкого варианта среды или 1820 г агар-агара для твердого варианта среды и доводят объем дистиллированной водой до 1 л. Смесь нагревают до расплавления агара, устанавливают рН на уровне 7,1 при по мощи 40%-ного раствора NaOH или 25%-ного раствора , разливают в пробирки или флаконы и стерилизуют при давлении 0,05 МПа (112°С) в течение 30 мин, Полученная среда обладает высокой ростовой активностью, П р и м. е р 1, Среда для выделения бифидобактерий. Предварительно кукурузный экстрак разводят водопроводной водой в соотношении 1:6, т.е. к 20 мл кукурузного экстракта добавляют 100 мл воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при давлении 0,05 МПа (112°С) в течение 30 мин. 872 ,4 В емкость, содержащую 700-800 мл дистиллированной воды, вносят 10 г пептона, 10 г лактозы, 60 мп предварительно разведенного в соотношении 1:6 и простерилизованного кукурузного экстракта, 200 мг соляно-кислого L-цистина, 5 г лимонно-кислого натрия трехзамещенного, 200 мп магния серно-кислого 7-водного, 0,5 г натрия фосфорно-кислого двухзамещенного 12-водного, 1,5 г калия фосфорно кислого однозамещенного, 20 г агарагара и доводят объем дистиллированной водой до 1 л. Смесь нагревают до расплавления агара, устанавливают рН на уровне 7,1 при помощи 40%-ного раствора NaOH или 25%-ного раствора ЫЩОН, разливают в пробирки высоким столбиком по 10 мл, после чего стерилизуют при 0,05 МПа в течение 30 мин. Перед посевом пробирки со средой нагревают в водяной бане до полного расплавления агара и охлаждают до , В каждую пробирку вносят по 1 мл взвеси испытуемого материала, предварительно разведенного физиологическим раствором до Посевы инкубируют при 37°С в течение 72 ч в условиях обычного термостата до образования типичных для бифидобактерий колоний. Пример 2. Среда для количественного учета бифидобактерий в молочных продуктах и бактериальных препаратах. Питательную среду готовят указан- ым в примере I способом, с внесеием агар-агара в количестве 2 г на 1 л, разливают высоким столбиком в робирки и стерилизуют по приведенноу режиму. Перед посевом пробирки со средой агревают в водяной бане до расплавения агара и охлаждают до 40°С. В аждую пробирку вносят по 1 мл взвеи посевного материала, предварительо разведенного физиологическим растором до 10. Посевы инкубируют 48 ч ри 37°С. Пример 3. Среда для лабораорного культивирования бифидобактеий. Предварительно кукурузный экстракт азводят водой в соотношении 1:6, .е. к 20 мл кукурузного экстракта обавляют 100 мл воды, фильтруют чеез ватно-марлевый фильтр и стерилиуют при 0,05 МПа в течение 30 мин. В емкость, содержащую 700-800 мл дистиллированной воды, вносят 9 г пептона, 9 г лактозы, 30 мл предварительно разведенного в соотношении 1:6 и простерилизованного кукуруэного экстракта, 100 мг соляно-кислого 1 цистина, 8. г лимонно-кислото нат рия трехзамещенного, 100 мг магния серно-кислого 7-водного, 1,0 г натрия фосфорно-кислого двухзамещенного ю 12-водного, 2 г калия фосфорно-кислого однозамещенного, 1 г агар-агара и доводят объем до 1 л. Смесь нагревают до расплавлешгя агара, устанавливают рН на уровне 7„2 при помощи 40%-ного раствора. NaOH или 25%-ного раствора NHbOH, разливают в пробирки высоким столбиком или во флаконы и стерилизуют при 0,05 МПа в течение 30 мин. Перед посевом среду регенерируют на водяной бане в течение Ю мин, охлаждают до 37°С и засеивают чистой культурой рабочего штамма бифидобактернй из расчета 5% инокулята от объема питательной среды. Посевы выдерживают при 37 С в течение 16 ч и более (в зависимости от видовой принадлежности) до интенсивного помутнения питательной среды. Количество жизнеспособных микробных клеток бифидобактерий, вырастаюшд х на предлагаемой питательной среде, составляет в 1 ни. Предлагаемая среда обяа,цает высокой ростовой активностью, имеет бо- лее низкую стоимость и может быть просто и быстро притотовленае Ф и де со ри л це сч вы де се од на ны ме ко ормула изобретения Питательная среда для вьщеления культивирования бифидобактерий, соржащая пептон, лак.созу, L-цистин . ошно-кислый, агар-агар, соль натя и дистиллированную воду, отичающаяся тем, что, с лью повышения качества среды за ет обеспечения стабильности ростох свойств, она дополнительно соржит кукурузный экстракт, магнийрно-кислый, калий фосфорно-кислый нозамещенный, а из солей натрия трий лимонно-кислый трехзамещенй, натрий фосфорно-кислый двухзашенньш при следующем соотношении мпонентов, масД: Пептон0,9-1,0 Лактоза0,9-1., О Кукурузный экстракт0,5-1.0 L-Цистин солянокислый 0, Натрий тшмоннокислый трехзамещенный О,5-0,8 Магний сернокислый OfOl-0,02 Натрий фосфорнокислый двухзамещенный О 3 О 5-0,1 Калий фос(:;{юрно кислый одноза0515-0,2 мещенный 0,--2,0 Агар-агар Дистиллиро ванОстальноеная вода

Изобретение относится к техниг ческой микробиологии, молочной промышленности, медицине и касается состава питательной среды для выделения и культивирования бифидобактерий в молочных продуктах лечебного и диетического питания, фекалиях и других субстратах. Цель изобретения - повьшение качества среды за счет обеспечения стабильности ростовых свойств. Предлагается питательная среда, содержащая, мас.%: пептон 0,9-1,0; лактоза 0,9-1,0; кукурузный экстракт 0,5-1,0; t -дистин соляноткислый 0,01-0,02; натрий лимонно-кислый трехзамещенный 0,5-0,8; магний серно-кислый 7-водный 0,010,02; натрий фосфорно-кислый двухс $ замещенный 12-водный 0,05-0,1; калий фосфорно-кислый однрзамещенный 0,15-0,2; агар-агар 0,1-2,0; дистиллированная вода - остальное. Содержание живых бактерий в 1 мл через 48 и 16 ч культивирования составляет для В. bifidunt , В. adolescentis МС42-10 -10. 2 табл. . IND 00 ю

Кукурузный экстракт0,50,3iOfB0;5 0,7

L-цис.тин солянокислый0,03

0,005 0,01

Таблица

0,5 1

0,02 0,01 0,01 0,02 0,01

Компоненты Натрий лимоннокислый трехэа10,30,6 мещенный Магний серио0,010,010,01 кислый 7-водный Натрий фосфорнокислый двухэамещенный 12-вод0,010,050,2 кый Калий фосфорнокислый одноза0,10,10,3 мещенньгй 0,0750,0750,1 Вода дистилОсталь- Осталь- Остал лированная ноеноенов

1271872

8 Продолжение табл.I

Таблица 2 0,6 0,50,70,60,8 0,010,020,010,010,02 0,050,10,150,10,1 0,20,150,250,20,2 0,1,0,20,21,82 сталь- Осталь- Осталь- Остальовновмоеное