ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ L-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и касается питательных сред для получения L-форм микобактерий из патологического материала, обеспечивает сокращение сроков роста и повышение выхода биомассы L-форм микобактерий.

Известна плотная питательная среда для выделения из биоматериала животных микобактерий туберкулеза и их культивирования, содержащая яйца куриные, малахитовый зеленый, калий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, пептон, глицерин, тетра или лента, или гексадекан, дистиллированную воду [«Питательная среда для культивирования микобактерий» RU 2410425 C1, C12N 1/20, C12R 1/32, 27.01.2011 г.].

Однако данная среда не является пригодной для культивирования L-форм, так как для них требуется полужидкая питательная среда, обеспечивающая необходимые для их роста осмотические условия.

Наиболее близким аналогом, т.е. прототипом, для выделения и культивирования L-форм микобактерий туберкулеза является полужидкая среда Дорожковой, которая содержит, мас.%:

калий фосфорнокислый - 0,026-0,035;

натрий фосфорнокислый - 0,25-0,33;

магний сернокислый - 0,05-0,07;

натрий лимоннокислый - 0,35-0,47;

железо аммиачное лимоннокислое - 0,005-0,007;

аспарагин - 0,41-0,56;

глицерин - 7,44-9,28;

агар - 0,25-0,3;

дистиллированная вода - остальное;

добавки к одному литру среды: сахароза 10; сыворотка крови крупного рогатого скота 10.

[Наставление по диагностике туберкулеза животных / МСХ РФ департамент ветеринарии 18.11.2002 г. с.17-16].

Однако известная среда не позволяет выделить в быстрые сроки из патологического материала L-культуры микобактерии, необходимые для опытов по изучению особенностей вызываемого ими инфекционного процесса. Кроме этого, она не обеспечивает достаточного накопления биомассы.

Задачей изобретения является создание среды для выделения из патологического материала L-культуры микобактерий, которая позволяет сократить сроки роста и повысить выход биомассы L-форм микобактерий.

Для решения поставленной задачи предложена среда, состоящая из следующих компонентов, мас.%:

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,026-0,035;

- магний сернокислый - 0,05-0,07;

- натрий фосфорнокислый - 0,25-0,33;

- железо лимоннокислое - 0,005-0,007;

- гликокол - 0,35-0,41;

- натрий глютаминовый однозамещенный - 0,1-0,2;

- глицерин - 0,3-0,4;

- агар - 0,3-0,4;

- дистиллированная вода - остальное;

дополнительно обогащена картофельным отваром 9-12% и сывороткой крови крупного рогатого скота 10-20%, что создает необходимую буферность и играет существенную роль в обмене веществ.

Эффективность прилагаемой среды для выделения L-форм микобактерий, которая позволяет сократить сроки роста и повысить выход биомассы L-форм микобактерий, проверена на трех вариантах испытуемых сред.

Питательная среда для выделения L-форм микобактерий «Испытуемая А» составлена из следующих компонентов, г/л:

калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5;

сернокислый магний - 0,5;

натрий фосфорнокислый - 2,5;

железо лимоннокислое - 0,05;

гликокол - 1;

глицерин - 40;

агар-агар - 3;

дистиллированная вода мл до 1000;

ингредиенты в указном порядке растворяют в дистиллированной воде, каждый ингредиент после растворения предыдущего, добавляют агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в автоклаве при 1 атмосфере, 120°С, 30 минут. За несколько дней до посева среду разогревают на водяной бане до температуры 40-45°С и в качестве стимулятора роста добавляют стерильный картофельный отвар 20% и сыворотку крови крупного рогатого скота 10%. Среду из колбы разливают в пробирки по 6 мл, проверяют на стерильность на протяжении двух суток.

Питательная среда для выделения L-форм микобактерий «Испытуемая Б» составлена из следующих компонентов, г/л:

калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5;

сернокислый магний - 0,5;

натрий фосфорнокислый - 2,5;

железо лимоннокислое - 0,05;

гликокол - 1;

натрий глютаминовый однозамещенный - 5;

глицерин - 40;

агар-агар - 3;

дистиллированная вода мл до 1000;

ингредиенты в указном порядке растворяют в дистиллированной воде, каждый ингредиент после растворения предыдущего, добавляют агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в автоклаве при 1 атмосфере, 120°С, 30 минут. За несколько дней до посева среду разогревают на водяной бане до температуры 40-45°С и в качестве стимулятора роста добавляют стерильный картофельный отвар 20% и сыворотку крови крупного рогатого скота 10%. Среду из колбы разливают в пробирки по 6 мл, проверяют на стерильность на протяжении двух суток.

Питательная среда для выделения L-форм микобактерий «Испытуемая В» составлена из следующих компонентов, г/л:

калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5;

сернокислый магний - 0,5;

натрий фосфорнокислый - 2,5;

железо лимоннокислое - 0,05;

гликокол - 2;

натрий глютаминовый однозамещенный - 10;

глицерин - 40;

агар-агар - 3;

дистиллированная вода мл до 1000;

ингредиенты в указном порядке растворяют в дистиллированной воде, каждый ингредиент после растворения предыдущего, добавляют агар, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в автоклаве при 1 атмосфере, 120°С, 30 минут. За несколько дней до посева среду разогревают на водяной бане до температуры 40-45°С и в качестве стимулятора роста добавляют стерильный картофельный отвар 20% и сыворотку крови крупного рогатого скота 10%. Среду из колбы разливают в пробирки по 6 мл, проверяют на стерильность на протяжении двух суток.

Результаты, полученные при сравнении трех вариантов питательной среды, представлены в таблице 1.

Сопоставительный анализ показал, что в отличие от Испытуемой А и Б использование предлагаемой питательной среды Испытуемой В позволяет сократить сроки первичного роста L-форм микобактерий в 2-3 раза, повысить интенсивность накопления биомассы в 2 раза, необходимых для дальнейшего изучения особенностей вызываемого ими инфекционного процесса, а также сократить время проведения работы.

Предлагаемая среда доступна для производства и отвечает современным требованиям при работе с заразным материалом, безопасная и эффективная при работе.

Источники информации

1. «Питательная среда для культивирования микобактерий» RU 2410425 C1, C12N 1/20, C12R 1/32, 27.01.2011 г.

2. Наставление по диагностике туберкулеза животных / МСХ РФ департамент ветеринарии 18.11.2002 г. с.17-16.

Дополнительные источники информации

1. «Способ реверсии L-форм микобактерий» RU 2275422 С2, C12N 1/20, C12R 1/32, 27.04.2006 г.

2. «Питательная среда для выделения и культивирования L-форм микобактерий туберкулеза» RU 2242511 С2, C12N 1/20, C12Q 1/04, 20.12.2004 г.

3. «Способ видовой дифференциации микобактерий туберкулеза» RU 2428484 С2, C12Q 1/04, C12N 1/20 20, 12.2010 г.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при приготовлении питательных сред для получения L-форм микобактерий из патологического материала. Питательная среда содержит калий фосфорнокислый однозамещенный, сернокислый магний, натрий фосфорнокислый, железо лимоннокислое, гликокол, натрий глютаминовый однозамещенный, глицерин, агар-агар, картофельный отвар, сыворотку крупного рогатого скота и дистиллированную воду в заданных соотношениях. Изобретение позволяет повысить выход биомассы L-форм микобактерий и сократить сроки накопления биомассы. 1 табл.

Питательная среда для выявления L-форм микобактерий из патологического материала, содержащая сыворотку крови крупного рогатого скота, агар, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит натрий глютаминовый однозамещенный, гликокол и в качестве стимулятора роста - стерильный картофельный отвар в следующем соотношении компонентов, мас.%:
калий фосфорно-кислый однозамещенный 0,026-0,035 серно-кислый магний 0,05-0,07 натрий фосфорно-кислый 0,25-0,33 железо лимонно-кислое 0,005-0,007 гликокол 0,35-0,41 натрий глютаминовый однозамещенный 0,1-0,2 глицерин 0,3-0,4 агар-агар 0,3-0,4 картофельный отвар 9-12 сыворотка КРС 10-20 дистиллированная вода остальное