Способ определения активности антитромбина-ВМ Советский патент 1986 года по МПК G01N33/52 

см

Изобретение относится к способу определения активности нового ингибитора тромбина которьй называется антитромбином ВМ ().

Определение АТ-ВМ основано на использовании различия в специфич ности по отношению к AT-III в случае различных кофакторов. К испытуемому раствору добавляют кофактор антитромбина ВМ, тромбин М опре .деляемый субстрат тромбина и по ко лйчеству продуктов расщепления субстрата тромбина судят об активности антитромбина-ВМ,

Пример , 9ч. свежеотоб ранной крови смешивают с 1 ч,. 0,11 моль/л цитрата натрия и центрифугируют при 3000 об./мин. полученной цитратной плазмы разбавляют 1,0 мл Q, раствора Ns-Cl,

5 МП раствора, содержащего 0,1 М трис/HCl, рН 8,1; 0,15 М NaCl, 0,ОГМ ЭДТА 1% полиэтиленгликоля, 6,5 IU апротинин/мл и I,75 USP гепарина/мл, смешивают с 0,25 мл раствора тромбина с О .,5 ед/мл и оставляют стоять в течение 30 мин (AT - реакционная смесь).

Проводят определение по следующей схеме при 25°С в кювете с толщиной слоя 1 см и при длине волны Hg405HM

Измеряется прирост экстинкции по сравнению с воздухом. В одну пластмассовую кювету вносят пипеткой 0,10 МП 0,9%-ного NaCl и 2 № АТ-ре акционной смеси, а в другую - 0,10мл разбавленной плазмы и 2 мл АТ-реакционной смеси5 смешивают и инкубирую В течение 5,мин при Затем содержимое каждой кюветы смешивает с 1,9 ммоль хромозима ТН - тоз-гли-проarg-pM.(0,20 мл), в течение 30 с определяют начальную экстинкцию.и одновременно включают секундомер. Через 30, 60 и 90 с повторяют определение Из разницы между коэффициентами тинкции (АЕ/ЗОс) определяют среднее значение.

Таким образом, получают общую аи- титромбиннзпо активность.

Путем повторения измерения с пониженной до 0,2 US Р/мл концентрации ей гепарина получают концентраияю AT-III. Из разнигды между общей анти- тромбинной активностью и AT-IIT по- лучают количество АТ-ВМ.

Пример 2, Используют следу кяцие растворы реагентов

1. Буфер: трис/НС1 100 ммоль/л, рН 8,1; декстрансульфат (м.в, 500 000) 1 мл/100 мл; апротинин 6,5 IU/мл (единица ингибитора; трипсин, хромозин ТН, 25°С; NaCl 150 ммоль/л.

2о Тромбин 0,5 ед/мл.

3.Хромозим ТН (тоз-гли-про-argpNA) 1,9 ммоль/л,

4,Смесь реагентов: трис/НС

90 ммоль/л, ,1; декстрансульфат 0,9 мг/100 I-OT; апротинин 5,9 IU/мл; NaCl 136 1 1моль/л; тромбин 0,045 ед/мл.

Приготовление смеси реагентов.

Смешивают в пластмассовой емкости и оставляют стоять примерно в течени 30 минут при 25°С 10 мл буфера (раствор 1 ) и 1 МП тромбина (раствор 2).

Подготовка, пробы.

Для определения 1 ч, цитратной плазмы разбавляют 200 ч 0,9%-ного NaCl (например,30 мл плазмы и 10 мл 0,9%-ного раствора NaCl).

Условия определения: длина волны Hg 405 нм; пластмассовая кювета, толщина слоя 1 см; температура измерения 25°С.

Измерение по сравнению с воздухом (прирост экстинкции)

Для каждой серии измерений требуется по меньшей мере одно холостое значение с тромбином (ть), В одну плмассовую кювету вносят пипеткой 0,05 мл 0,9%-ного NaCl и J мл раствора 4, в другую - 0,05 мл разбавленной плазмы и 1 мл раствора 4, сме шивают, инклгбируют в течение 5 мин при 25°С. Затем содержимое каждой кюветы смешивают с раствором 3 (TL 0,1 мл проба 0,1 ми) и рассчитывают АЕ/30 с; АЕц /30 с - ДЕрроБЫ/ЗО с с. 1ид..5,/мл AEft / /30 с X 95,

Для определения готовят растворы AT-III (концентрация 12,5 IU/мл при 25°с) и АТ-ВМ (концентрация 12,1 IU/мл при 25°С).

Эта концентрация соответствует нормальному содержгшйю AT-III в человеческой гшазме.

Для того, чтобы показать специфичность определения в присутствии AT- AT-III, определение проводят как с раствором AT-ВМ, так и со смесью обоих растворов.

Измерение AT-ВМ„

1 ч. раствора АТ-ВМ разбавляют 100 ч„ физиологического раствора NaCl (0,05 МЛ пробы + 5,0 м.ч раствора NaCl), Из этого раствора готовят даль™ нейгаие разбавления с физиологическим раствором поваренной соли (9 ч. ра 5 створа АТ-ВМ + I ч. раствора NaCl; 8+2; 7+Злт.д. вплоть до конечного разбавления 1:1000). Постоянные объемы (0,05 мл) приготовленных разбавлений затем используют в тесте, согласно которому измеряют внутри выбранных пределов пропорциональные величины подавления (см. чертеж). Измерение АТ-ВМ в присутствии 5 AT-III. 0,05 мл раствора AT-БМ разбавляют 0,05 МП раствора AT-III и 4,95 мп физиологичесдсого раствора поваренной соли (соответственно 1:100 разбавле- 20 ние обоих компонентов). Из полученного раствора готовят серию разбавлений аналогично описан ному вьппе. Постоянные объемы (0,05 мп) при- 25 готовленных разбавлений затем используют в тесте (см. чертеж). Как видно из данных, приведенных на чертеже, наличие AT-III не влияет на результат измерений, измеряется 30 только АТ-ВМ. J Аналогичные результаты получаютпри использовании декстрансульфата, сложных эфнров мукополисахар1еда с полисерной кислотой, пентоззнполи- 35 сульфатов или короткоцепочечнмх про зводных гепарина. Пример 3. Влияние концентрации тромбина на определение AT-III. В качестве пробы приг еняли водный 40 раствор AT-III о Применяли реактив по примеру 1: трис-буфер, рН 8,1; гепарин, 1,75 US Р/мл; субстрат 0,19 ммоль/л. Результаты определения приведены 45 в табл. 1.. Т а б л и ц а 1

17,0 17,2 17,3

11,9 12,04 12,11 137 р с р р р р в Хр S ра с ра ре рН су в

Пример 6. Влияние концентрации декстрансульфата на определе ние аититромбина-ВМ.

В качестве пробы применяли водньйГ раствор AT-ВМ. Применяли реактив по примеру 2: трис-буфер, рН 8,1; тром бин, 0,05 ед./млI субстрат

0,J9 ммоль/л.

Результаты определения приведены

в табл. 4. 4 Пример А. Влияние концентции тромбина на определение АТ-ВМ с гепарином. В качестве пробы приняли водный створ антитромбина-ВМ. Применяли актив по примеру 1: трис-буфер, 8,1; гепарин 1,75 US Р/мл; субст т 0,19 ммоль/л.. Результаты определения приведены табл. 2. Таблица 2 Субстрат Определение АТ-ВМ с гепарином, IU/мл, в присутствии троъ бина, ед./мл мозим ТН 16,5 21,30 22,35 238 11,58 14,90 15,60 Пример 5. Влияние концентии тромбина на определение АТ-ВМ екстрансульфатом. В качестве пробы применяли водный твор антитромбина-ВМ, Применяли ктив по примеру 1: трис-буфер, 8,1; декстраисульфат, 10 мкг/мл; страт, 0,10 ммоль/л. Результаты определения приведены абл. 3. ТаблицаЗ Определение AT-ВМ Субстрат с декстрансульфатом, .IU/мл, в при- сутствии тромбина, ед/мл

12713796

Субстрат

Таблица 4

Определение , IU/мл, в присутствии декстрансульфата, Mfcr/мл

Изобретение относится к медицине, а именно к способу опр еделения активности антитромбина-ВМ. Цитрат- ную плазму разбавляют 0,9%-ным раст вором NaCl. Готовят антитромбинную (AT) реакционную смесь. В пластмассовые кюветы вносятся растворы АТ-реакционной смеси и 0,9%-ного NaCl в одном случае и разбавленная плазма и AT-реакционная смесь в другом случае. Эти смеси инкубируют в течение 5 мин и смешивают с 1,9 ммоль хромозима ТН. В течение 30 с определяют начальную экстинкцию. Через 30, 60 и 90 с повторяют измерение. Из разницы между коэффициентами экстинкции определяют среднее значение. Таким образом, получают общую антитромбинную активность. При повторении измерения с пониженной концентрацией гепарина получают AT-III о Из разницы между СО общей антитромбинной активностью и с AT-III получают количество антитромбина-ВМ, 5 табл. 1 ил. ю со со

Хромозим ТН 36,14 44,70 43,76 S 2238 25,29 31,29 31,43

Пример 7, Зависимость активности тромбина от концентрации Концентрация хромозима ТН, ммоль/л 0,019 0,038 Активность тромбина, дЕ/мин 0,079 0,123 Работу осуществляли с реактивом по примеру 1 (определение исходного значения тромбина в соответствии с указанным примером). Концентрация тромбина в тесте составляла .тромбина в тесте составляла 0,015 ед/мл. Как показали экспериментальные данные, тест можно осуществлять при концентрациях субстрата 0,019 - 0,285 ммоль/л. Поскольку субстрат S 2238 имеет почти идентичное К, значение 9 х X 10 моль/л, для этого субстрата действительна такая же граничная об ласть. Расчет концентраций тромбина, ге парина или декстрансульфата в тесте Определение концентрации тромбин (ед/кп) производили, исходя от изме ренного в тесте сигнала ЛлЕ/ЗО с), следующим образом: .V X 2 &х V где V - примененный в тесте объем (2,30 мл); .

; субсрата-хромозима ТН(тоэ-глипро-агп рНА м-эначение 2x10 моль/л.

Таблица 5 0,076 0,114 0,152 0,190 0,285 0,144 0,156 0,158 0,157 0,155 - коэффициент экстинкции для п Нитроанилина(9,70 см мкмоль .V - объем пробы тромбина (AT-peакционная смесь 2,00 мл); 2 - фактор необходимый для того, что бы получить ЛЕ/МИН. Если, например, получали сигнал тромбина А Е/0,500/30 с, то в АТ-ре- акционной смеси концентрация тромби на составляла 0,12 ед/мл. При даль нейшем разбавлении примененной в тесте смесью (2,30 мл), концентрация тромбина в тесте становится равной 0,10 ёд/мл. Препарат гепарина характеризуется количеством USP- диниц в 1 мл. Например, концентрация гепарина 1,00 USP/мл в буферном растворе дает кон центрацию 0,95 USP/мл в АТ-реакциойной смеси (а именно, 5,0 мл буферного раствора смешивают с 0,25 мл раствора тромбина). Тогда в тесте оказывается концентрация гепарина 0,83 USP/мл, так как в тесте АТ- зеакционаую смесь разбавляют от 2 до 2,30 мл)