Реактив для определения формиата или соединений, переходящих в формиат Советский патент 1981 года по МПК G01N33/54 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к составам для определения формиата или соединений, переходящих в формиат. Известен реактив для определения формиата или соединений, переходящих в формиат, на водной основе, содержащий аденозинтрифосфат и тетрагидрофолиевую кислоту l . Недостатком указанного реактива является его низкая эффективность. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемо му результату является реактив для определения формиата или соединений переходящих в формиат, на водной ос нове, включающий аденозинтрифосфат, триэтаноламин, хлорид магния, ацета натрия, гидроокись калия И тетрагид рофолиевую кислоту L JНедостатком известного реактива для определения формиата или соединений, переходящих в формиат, является также его низкая эффективность Цель изобретения - повьпаение эффективности реактива. Поставленная цель достигается тем, что реактив для определения фо миата или соединений, переходящих в формиат, на водной основе, дополнительно содержит формиатдегидрогеназу из Candida bo id i nil никoти lдeн-.индинуклеитид лития, динатрийфосфа т -й мононатрийфосфат при следующем соотношении компонентов, вес.%: Формиатдегдцрогеназа из Candida 0,001-0,1 boidini 1 Никотинаденин0,007-0,7 динуклеотид лития 0,153-3,1 Динатрийфосфат 0,01-0,20 Мононатрийфосфат Остальное Вода Пример 1. А . Получение фермента. 400 г Candida boidIпii , культивируемого на метаноле, в глубокозамороженном состоянии размораживают в 1200 мл 50п М раствора аммонсульфата и держат в нем 1 ч при 37 С. Потом рН суспензии устанавливают с помощью 10%-ного раствора полиэтиленамина на значении 7,5. Осадок центрифугируют, выдерживают в 9%-ном по объемурастворе фосфатгеля с рН 7,5 и спустя ЗО мин центрифугируют. После промывания 0,5 М раствором Nad гель экстрагируют с помощью 0,2 М фосфатного буфеоа с

рН 7,5. Экстракт помещают в 3,2 М раствор аммонсульфата, причем рН поддерживается равным 7,5. Образованный осадок отделяют и после растворения в фосфатном буфере (рН 7,5) хроматографируют через ДЕАЕ-целлюлоэу (целлюлоза, модифицированная соединением диэтиламиноэтанола), причем , элюирование осуществляют с увеличением концентрации буфера фосфата с рН 7,5. Содержание ФДГ фракции объединяют, вновь вносят на 3,2 М раствор аммонийсульфата, оставляя рН постоянным. Осадок отделяют, растворяют в фосфатном буфере с рН 7,5 и после диализа обрабатывают гидроксилапатитом. После отделения гидроксилапатита раствор лиофилизируется.

Выход 0,7 г лиофилизата со специфической активностью около 3,мг протеина. Общий выход составляет 43%

Б. Определение формиата.

0,02 мл 0,100 М водного НАД-раствора, 0,02 мл 2,5/JM раствора формиата натрия и 0,8 мл 0,05 М фосфатбуфера с рН 7,5 перемешивают между собой и доливают до 1,0 мл воды.

В пробе, взятой для сравнения, раствор формиата заменяется равным количеством воды. Для обеих проб при 366 нм измеряется начальная экстракция . После этого реакция продолжа ется за счет добавления 0,2 и ФДГ. Спустя 30 мин определяется конец экстинции.

Результат вычисляют .с величиной для НАДН 3,4 cм -/fJ|K по литературным данным. В 6-ти параллельно проводимых опытах получается значение при коэффициенте вариации 1,28%. Таким образом,- результат статически не должен отличаться от теоретически определенной величины.

Определения в этих случаях проводят следующим образом.

Пример 2. Определение оксалата.

А. Оксалатадекарбоксилазу из Collybialutipes растворяют в 1 мл 0,2 моль/л и цитратнсрго буферного раствора с рН 4,О«К 0,07 мл этого раствора смешивают Q 0,1 мл раствора пробы оксалата 0,5 1 оль/л и 30 мин выдерживают при комнатной температуре. Затем к пробе оксалата прибавляют 0,8 мл реактива из примера 1. После смещения замеряют экстинкцию при 366 нм и прибавляют формиатдегидрогеназу. После 30 мин выдерживания при комнатной температуре снова измеряют экстИнкцию.

Результаты рассчитывают по лите .ратурным данным для НАДН -3,4 см /ммоль 99,4% взятой величины) .

В трех параллельных опытах получают 0,0497 ммоль (99,4% взятой величины) .

0,01 мл 0,010 м/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 ммоль/л раствора натрийформиата и 0,1 мл 0,05 моль/л фосфатного буферного раствора с рН 7,5 смешивают и доливают до 1,0 мл воды.

В сравнительной пробе раствор формиата заменяется одинаковым количеством воды. ,Цля обеих проб измеряется затем начальная экстинкция при (366 нм. В результате добавки 0,04 ед ФДК начинается реакция. Через 50 мин считьшается конечная экстинкция, ;

Результат рассчитывают с литератур ной величиной для НАДН 3,4 см / моль. При 6 параллельных опытах получается 0,0502 мол ,3% введенной величиньГ при вариационном коэффициенте 1,29% .

Б, Верхний предел

мг%

12HJ3 30,593,059

. Hg.O 2,020,202 .

НАД-Li 2Й20 7,050,705

адг. 1,430,143

«2°

Остальное Остальное

0,01 мл 0,01 моль/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раствора на г-рнйформиата и 0,8 мл 0,125 моль/л фосфатного буферного . раствора с рН 7,5 смешивают и доливают до IjO мл воды,

В сравнительной пробе раствор формиата заменяется одинаковым количеством воды. Для обеих проб измеряется затем начальная экстинкция при 366. нм. Потом начинается реакция в результате добавки 5,0 ед« ФДГ. Через 10 мин считывается конечная экстинкция.

Результат рассчитывают с литерату рной величиной для НАДН 3,4 см /моль. При 6 параллельных опытах получается 0,0504 ммоль (100,7% введённой величины при вариационнбм коэффициенте 1,28%).

в. . мг %

Na2.HP04 12Н„0 6,12

0,612 МаНоРОл- 0,40 0,040 НАД-Li-ZH O 0,07 0,007 ФДГ- 1,43 0,143

Hg O991,98 99,198

0,01 мл 0,01 моль/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раствора натрийформиата и 0,4 мл О,05 моль/л фосфатного буферного раствора смешивают и доливают до О, 2 мл воды,

В сравнительной пробе раствор фомиата заменяется одинаковым количеством воды. Для обеих проб измеряется затем началь.ная экстинкция при 366 нм, В результате добавки 5,0 ед ФДГ начинается реакция. Через 10 ми считывается конечная экстинкция.

Результат рассчитывают с литературной величиной для НАДН 3,4 сМ //моль. При 6-ти параллельно проводимых опытах получается 0,0492 моль (98,3% введенной величи ны при вариационном коэффициент те 1,31%) . Na HP04-12Hj,D 24,48 2,448 М.аНлРОлН О 1,611 0,161 НАД-112Н20 7,05 0,705 ФДГ 0,056 0,006 Пример 3. Определение эфирамуравьиной кислоты. 1 ммоль эфирамуравьиной кислоты нагревают в водном растворе с 1,3 моль NaOH до тех пор, пока не перестанет изменяться величина рН. Затем рН реакционного-раствора уста навливают на 7,5 фосфорной кислотой добавкой воДы снижают концентрацюо образовавшегося формиата до 2,0 ммоль/л, а затем, как и в преды дущем примере, проводят определение добавкой реактива из примера 1. П р и м е р 4. СЦ. Нижний предел ,1.0,1 мл 0,10 моль/л водного НАДраствора, 0,02 мл 2,5 моль/л раств ра натрийформиата и 0,8 мл 0,10 моль/л фосфатного буферного раствора с рН 7,5 смешивают и доли вают до 1,0 мл воды.

Формиатдегидрогеназа из Candida

0,001-0,1 bo I d i п i i

0 Никотинаденин0,007-0,7 динуклеотид лития 0,153-3,1 Динатрийфосфат

0,01-0,20 Мононатрийфосфат Остальное Вода в сравни: ельной пробе растрор формиата заменяется одинаковым количеством воды. Для обеих проб измеряется затем начальная экстинкция при 366 нм. В результате добавки 0,2 ед. ФДГ начинается реакция. Через 30 мин считывается конечная экстинкция. Результат рассчитывают с литературной величиной для НАДН 3,4 см / моль. При 6 параллельных опытах получается 0,0494 моль (98,7% введенной величины при вариационном коэффициенте .2,3%). Формула изобретения Реактив для опред гления формиата или соединения, переходящих в формиат, на водной основе, о т л и чающийся тем , что, с целью повьшения эффективности реактива, он-лополнительно содержит формиатдегидрогеназу 13 Candida boidiпfi никот1инадениндинуклеотид лития, динатрийфосфат имононатрийфосфат при следующем соотношении компонентов, вес.%: Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Bergmeyer H.U. Methoden der enzymat i schen Analyse, 3- An-flage, Band il, 1974,, s 1591-1596, 2.Bergmeyer H.U. Methoden der enzymatIschen Analyse, 3. Anflage, Band M, 1974,s 1591-1596 (прототип ) .