Способ выделения анионных фосфолипидов Советский патент 1987 года по МПК C07F9/10 G01N33/50 

родных соединений, конкретно к способам получения индивидуальных фосфо- липидов, и может быть использовано

для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты, затем 120 мл 0,02М раствора формиата аммония. Пблученпри изучении структуры и функций кле- ная фракция содержит 0,0225 г монофосфоинозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. После -ЭТОГО через колонку пропускают 120мл 0,1 М раствора формиата аммония. По- 10 лученная фракция содержит 0,0034 г кардиолипина, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. Далее через колонку пропускают 120 мл 0,4 М раствора формиата аммония. Полученчетать элементы афинной и ионообмен- 15 пая фракция содержит 0,0032 г дифос- ной хроматографии, и подбора систем фоинозитида, выход 99% от исходного

точных мембран, а также для приготовления липосомальных препаратов, биологически активных эмульсий, антигенных препаратов для диагностики сифилиса.

Целью изобретения является повышение чистоты и выхода продукта.

Цель достигается за счет используемого адсорбента позволяющего со

содержания, чистота 100%. В заключение колонку промывают 120 мл 1 М раствора формиата аммония. Получен- 20 ная фракция содержит 0,0034 г три- фосфоинозитида, выход 99% от исходного- содержания, чистота 100%.

растворителей для элюирования.

Пример. U Разделение сме си фосфолипидов из моэга крупного рогатого скота.

Свежий мозг (10 г) гомогенизирую в 200 мл системы хлороформ-метанол (1:1), а остаток повторно экстрагируют 200 мл системы хлороформ - метанол (2:1). Полученный суммарный экстракт, содержащий 0,45 г фосфолипидов, наносят на колонку с. макропористым силикагелем tinC-1000-ВГХ, содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 20 мл.

Для приготовления элюируюнщх систем используют растворы формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4).

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 60 мл системы хлороформ - метанол (:). Полученная фракция содер жит 0,181 г нейтральных липидов. Затем через колонку пропускают 60 мп системы хлороформ - метанол (1:2). Полученная фракция содержит следы нейтральных липидов, а также 0,146 г смеси фос- фатидилхолина и фосфатидилэтанолами- на. После этого колонку промывают 120 мл системы хлороформ - метанол - муравьиная кислота (1:2:0,1). Полученная фракция содержит 0,0045 г фос фатидной кислоты, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. Затем колонку промывают 120 мл системы хлороформ - метанол - муравьиная кислота (1:2:0,2). Полученная фракция содержит О,081 г фосфатидил- серина, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. Далее колонку промывают 40 мл системы хло

для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты, затем 120 мл 0,02М раствора формиата аммония. Пблучен5 пая фракция содержит 0,0032 г дифос- фоинозитида, выход 99% от исходного

5

содержания, чистота 100%. В заключение колонку промывают 120 мл 1 М раствора формиата аммония. Получен- 0 ная фракция содержит 0,0034 г три- фосфоинозитида, выход 99% от исходного- содержания, чистота 100%.

Пример 2. Разделение смеси МОНО-, ди- и трифосфоинозитидов, выделенных из мозга крыс.

Образцы МОНО-, ди- и трифосфоинозитидов растворяют в 10 мл системы хлороформ - метанол (1:1) и полученный раствор, содержащий 0,09 г суммарных фосфолипидов, наносят на колонку с макропористым силикагелем МПС - 1000-ВГХ, содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл.

0

5

0

5

0

5

Для приготовления элюирующих систем используют растворы формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4).

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 15 мл системы хлороформ - метанол (1:1) для удаления следов нейтральных липидов, фосфатидилхолина и фосфатидил- этаноламина и 15 мл системы хлороформ - метанол муравьиная кислота (1:2:0,05) для удаления следов фос- фатидной кислоты и фосфатидилсерина. Далее колонку промывали 10 мл системы хлороформ метанол - вода (1:2: :0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты, затем 30 мп 0,01 М раствора формиата аммония. Полученная фракция содержит 0,03 г мо- нофосфозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%. Затем колонку промьшали 30 мп 0,4 М раствора формиата аммония. Полученная фракция содержит 0,029 г дифосфоиноfO

зитида, выход 99% от исходного, чистота 100%, В заключение колонку промывают 30 мл 1 М фосфора формиата аммония. Полученная фракция содержит 0,03 г трифосфоинозитида, выход 99% от исходного, чистота 100%.

Пример 3 . Вьщеление монофос- фоинозитида из пекарских дрожжей.

Суммарный липидный хлороформно-ме танольный (1:1) экстракт, содержащий около 0,5 г липидов, полученньш из пекарских дрожжей известным способом, наносят на колойку с макропористым силикагелем МПС - 1000-ВГХ, со- держапщм неомицин, присоединенный из- -5 вестным способом. Объем адсорбента 5 мл.

После нанесения смеси фосфолипи- дов через колонку пропускают по 30 мл системы хлороформ - метанол (1:1) и 30 мл системь хлороформ - метанол (1:2). Полученные фракции содержат 0,44 г нейтральных и цвиттерионных липидов (фосфатидилхолин, фосфатидил- этаноламин и их лизопроизводные). После этого колонку промывают 30 мл системы хлороформ - метанол - муравьиная кислота (,li j2:0,2), получая 0,01 г фосфатидилсерина. Затем колон20

25

ные и цвиттерионные липиды (фосфати дилхолин, фocфaтидилэтaнoлa fflн и их лизопроизводные). После этого 30 мл смеси хлороформ - метанол - муравьиная кислота (1:2:0,2) вымывают фос фатидилсерин. Затем колонку промыва ют 10 мл системы хлороформ - метано вода (1:2:0,4) для удаления с колон остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,05 М раствора формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4). Полученна фракция содержит 0,033 г кардиолипи на, выход 99%, чистота 100%.

Пример 5. Выделение кардио липина из сердечной мышцы крупного рогатого скота.

Раствор суммарных фосфолипидов сердечной мьшцы в системе хлороформ метанол (1:1), полученный как описа но в примере 4, наносят на колонку с макропористым силикагелем МПС- 1000-ВГХ, содержащим L-лизин,, присо единенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл.

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мл системы хлороформ - метанол (1:1) и 30 мл системы хлороформ - метанол

ку промывают 10 мл системы хлороформ - р:2). Полученные фракции .содержат

метанол - вода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мп 0,01 М раствора формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4).

Полученная фракция содержит 0,05 г монофосфоинозитида, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%.

Пример 4. Выделение кардио- липина из сердечной мьшщы крупного рогатого скота.

Сердечную мышцу (80 г) гомогенизируют с 600 мл ацетона, а остаток дважды экстрагируют 600 мл метанола. Метанольный экстракт, содержащий ,4 г суммарных фосфолипидов, упаривают остаток растворяют в системе хлороформ - метанол (1:1), отфильт- ровьшают и наносят на колонку со сфе- роном Р-300 (оксиэтилметакрилатный гель) содержащим неомицин, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл.

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мл смеси хлороформ - метанол (1:1) и 30 мл смеси хлороформ - метанол (1:2), вымывая фракции, содержащие,нейтраль40

нейтральные и цвиттерионные фосфо- липиды (фосфатидилхолин, фосфатидил этаноламин и их лизопроизводные). После этого системой хлороформ - м 35 танол - муравьиная кислота (1:2:0,2 вымывают фракцию, содержащую фосфа- тидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ - метанол - вода-(1:2:0,4) для удаления с колон ки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,02 М раствора фо миата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4). Полученна фракция содержит 0,033 г кардиолипи на, вькод 99%, чистота 100%.

Пример 6. Выделение кардио липина из сердечной мышцы крупного рогатого скота.

Раствор суммарных фосфолипидов сердечной мышцы в системе хлорофор метанол (1:1), полученньш как описа но в примере 4, наносят на колонку с аминосилохромом 350/80. Объем адсорбента 5 мл.

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мл системы хлороформ - метанол (1:1) и 30 мл системы хлороформ - метанол

45

50

55

-5

0

5

ные и цвиттерионные липиды (фосфатидилхолин, фocфaтидилэтaнoлa fflн и их лизопроизводные). После этого 30 мл. смеси хлороформ - метанол - муравьиная кислота (1:2:0,2) вымывают фос- фатидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ - метанол- вода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,05 М раствора формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4). Полученная фракция содержит 0,033 г кардиолипи- на, выход 99%, чистота 100%.

Пример 5. Выделение кардио- липина из сердечной мышцы крупного рогатого скота.

Раствор суммарных фосфолипидов сердечной мьшцы в системе хлороформ - метанол (1:1), полученный как описано в примере 4, наносят на колонку с макропористым силикагелем МПС- 1000-ВГХ, содержащим L-лизин,, присоединенный известным способом. Объем адсорбента 5 мл.

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мл системы хлороформ - метанол (1:1) и 30 мл системы хлороформ - метанол

0

нейтральные и цвиттерионные фосфо- липиды (фосфатидилхолин, фосфатидил- этаноламин и их лизопроизводные). После этого системой хлороформ - мё- 5 танол - муравьиная кислота (1:2:0,2) вымывают фракцию, содержащую фосфа- тидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ - метанол - вода-(1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,02 М раствора формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4). Полученная фракция содержит 0,033 г кардиолипи- на, вькод 99%, чистота 100%.

Пример 6. Выделение кардио- липина из сердечной мышцы крупного рогатого скота.

Раствор суммарных фосфолипидов . сердечной мышцы в системе хлороформ- метанол (1:1), полученньш как описано в примере 4, наносят на колонку с аминосилохромом 350/80. Объем адсорбента 5 мл.

После нанесения смеси фосфолипидов через колонку пропускают 30 мл системы хлороформ - метанол (1:1) и 30 мл системы хлороформ - метанол

5

0

5

(1:2), Полученные фракции содержат нейтральные и цвиттерионные лнпиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтанол- амин и их лизопроизводные). После этого 30 мл системы хлороформ - метанол - муравьиная кислота (1:2:0,2) вымывают фосфатидилсерин. Затем колонку промывают 10 мл системы хлороформ - метанолвода (1:2:0,4) для удаления с колонки остатков муравьиной кислоты и в заключение 30 мл 0,1 М раствора формиата аммония в системе хлороформ - метанол - вода (1:2:0,4). Полученная фракция содержит 0,033 г кардиолипина, выход 99% от исходного содержания, чистота 100%.

Предлагаемый способ позволяет выделить из сложньрс сМесей фосфоли- пидов за одну стадию индивидуальные анионные фосфолипиды с выходом 99% и чистотой 100%, тогда как по известному способу выхОД анионных фосфолипидов составляет 90% от исходРедактор Н. Гунько

Составитель А. Переверзева

Техред А.Кравчук Корректоре. Шекмар

Заказ 7557/26 Тираж 347 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий И3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

„ Г|Ц J,, , --. .1 . LI-I.„„.-.«-,- ,-.- - .e.«w.- - .- - - .- - .««-.- --- - -- -

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

ного содержания в ткани, чистота 90%.

Формула изобрет-ения

Способ вьщелёния анионных фосфолипидов путем хроматографирования экстрактов природного сырья на твердых носителях с использованием для элюирования систем на основе хлороформа и метанола, отличающий- с я тем, что, ,с целью повышения выхода и чистоты продукта, зкстракт, содержащий смесь фосфолипидов, наносят на колонку с аминрсилохромом или макропористым силикагелем, модифицированным неомицином или L-лизином, а злюацию осуществляют системой, содержащей хлороформ - метанол - муравьиную кислоту в объемном соотношении 1:2:(0,05-0,2), или системой, содержащей 0,01-1 М раствор формиата аммония в смеси растворителей хлороформ - метанол - вода в объемном соотношении 1:2:0,4.

Изобретение относится к химии природных соединений, а именно к способам получения индивидуальных фосфолипидов, может быть применено в изучении структуры и функций клеточных мембран и для приготовления липосо- мальных препаратов, биологически активных эмульсий, антигенных препаратов для диагностики сифилиса. Цель изобретения - повышение чистоты и выхода продукта достигается тем,что используют адсорбент, позволяющий сочетать ионообменную и афинную хроматографию и подбирают растворители для элюирования. Для этого разделяли смеси фосфолипидов из мора крупного рога. Свежий мозг гомогенизируют в-системе хлороформ - этанол (IH), остаток экстрагируют в той же системе