Способ количественного определения микроорганизмов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/543 

1 12

Изобретение относится к способам измерения, использующим биологически активные вещества, а именно специфическому способу определения количества бактериальных клеток в биологиче- ских жидкостях и культуральной среде и может быть использовано в клинической микробиологии, микробиологической промышленности, и в других отраслях промышленности, где необходим контроль биозараженности.

Известен способ количественного определения микроорганизмов, предусматривающий связывание их со специфическими антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы. Для проведения анализа по известному способ анализируемый образец, содержащий клетки микроорганизмов, инкубируют с иммобилизованньми на твердом носи- теле антителами, специфическими к поверхностным детерминантам клетки (40-60 мин). Затем иммуносорбент, связавший клетки, несколько раз по 5-10 мин промывают и инкубируют с ан тителами, мечеными ферментом.

Продолжительность второй инкубаци 40-60 мин. После этого сорбент тщательно отмывают (4-5 раз в течение Ю мин) от несвязавшегося конъюгата антител с ферментом, и фермент, связанный с носителем.выявляют, определяя его активность. Для этого к отмытому носителю добавляют смесь субстратов (о-фенилен-диамин и перекись водорода). Конечный результат регистрируют измерением оптической плотности окрашенного продукта реакции, нарабатываемого в течение 30 мин. Общее время анализа около 3-4 ч. Пре- дел обнаружения .З-10 кл/мп.

Известный способ обладает следующими недостатками: определяются не только целые клетки, но и их фрагменты, что существенно влияет на пра- вильность получаемых результатов, длительность анализа.

Цель изобретения - ускорение процесса и и повышение точности определения микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем, цто согласно способу количественного определения микроорганизмов, предусматривающему связывание их со специфическими антителами, сорбирован- ными на поверхности твердой фазы, связанные микроорганизмы обрабатывают щелочным раствором, содержащим 10 -10 М додецилсульфата натрия

f 0 5

о Q

е

5

5

70-2

(ДСН), с последующим определением в полученной смеси люминесцентным методом концентрации выделившегося из клеток гемина, по которой с помощью калибровочной кривой определяют концентрацию микроорганизмов.

Способ осуществляют следующим образом.

Пробу анализируемой жидкости, содержащую бактериальные клетки, смешивают с иммуносорбентом. Соотношение объема пробы и объема иммуносорбента варьируется в зависимости от типа используемого сорбента и составляет 100 мкл;50 мкл-100 мкл:400 мкл. После инкубации в течение 40-60 мин, необходимой для связывания клеток с иммобилизованными антителами, сорбент промВ1вают три раза 0,01 М К- фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 М NaCi и 0,05% тритона Х-100. После этого образец иммуносорбента со связанными клетками подвергается обработке 0,2 М раствором NaOH, содержащим М ДСН в течение 3-5 мин. В процессе этой обработки происходит разрушение клеточной оболочки и осуществляется перевод гемина с твердой фазы в раствор. Аликвота раствора затем вносится в пробирку кюветного отделения люминометра, в которую добавляются люминол и перекись водорода.

Гемин катализирует реакцию окисления люминола Н 0, сопровождающуюся излучением света. Интенсивность люми- .несценции пропорциональна концентрации гемина и, следовательно, количеству клеток, связавшихся с иммуносорбентом. Количество, клеток в образце определяют по калибровочной кривой зависимости интенсивности излучения от содержания клеток в стандартных растворах.

Пример 1. Построение калибровочного графика и определение количества клеток E.coli.

Культуральную жидкость, содержащую 10 клеток/мл E.cofi разводят 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,15 М NaCI в следующих соотношениях: 1:10, 1:100, 1:200, 1:500,1:2000. Затем 0,5 мл раствора каждого разве- .дения смешивают с 400 мкл суспензии .CNBr-сефарозы с иммобилизованными ан- ;тителами к E.coli. Смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин, после чего иммуносорбент промывают 0,01 М К-фосфатньпч буфером (рН 7,4), содер31

жащим 0,05% тритона Х-100. Пробирки центрифугируют, удаляют надосадок и добавляют в каждую из них 1500 мкл 0,2 М раствора NaOH, содержащего 5-10 М ДСН и перемешивают. После инкубации в течение 3 мин из каждой из них отбирают 960 мкл раствора и помещают в кювету люминометра. Затем в эту же кювету автоматически вносят 20 мкл раствора люминола (10 М) и после 10 с инкубации реакцию инициируют добавлением 20 мкл Н 0 (5 х X 10 М), измеряют интенсивность хемлюминесценции и строят калибровочный график зависимости интенсив- ности излучения от количества клеток используемых в стандартных образцах Содержание .клеток в стандартном.образце контролируют методом световой микроскопии. Содержание клеток в не- известном образце (N) определяют по калибровочному графику. Предел обнаружения клеток E.coli - 10 клеток/м

П р и М е р 2. Построение калибровочного графика и определение био- массы актиномицетов Streptomyces chrysomallus.

Прямой подсчет клеток актиномицетов является затруднительным из-за образования агрегатов клеток неопре- деленного состава, поэтому определение ведут по сухому весу. Из суспензии микроорганизмов 1:2, 1:3, 1:5, 1:8, 1:10 готовят разведения (по 12 мл). Бумажные фильтры (5 шт) высушивают при 80°С до постоянного веса, затем на них наносят 3 мл суспензии клеток, фильтруют, фильтры высушивают в эксикаторе над CaCt. Фильтры помещают на 1 ч в сушильный шкаф при , взвешивают, при этом разница в весе после нанесения суспензии клеток и чистого фильтра соответствует сухому весу биомассы в 3 мл клеточной суспензии.

Для опр.еделения биомассы 3 мл соответствующего разведения суспензии микроорганизмов инкубируют с иммобилизованными антителами к Streptomyces chrysomallus. Далее способ осуществляют согласно примеру 1. Пре дел обнаружения - 5 мг/мл.

П р и М е р 3, Определение клеток E.coli в смеси микроорганизмов.

Суспензию, содержащую E.coli и 10 клеток/мл Bacillus subtilis разводят 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,15 М NaCl в следующих соотношениях: 1:10, 1:100, 1:200,

704

1:500, 1:2000. Затем 0,5 мл раствора каждого разведения смешивают с 400 мкл суспензии CNBr-сефарозы с иммобилизованными антителами к E.coli. Инкубацию с иммуносорбентом, последующую экстракцию гемина и определение интенсивности хемлюминес- ценции проводят, как в примере 1. Затем строят график зависимости интенсивности хемлюминесценции от количества клеток в пробе . Образец среды, содержащей неизвестное количество клеток, разводят 1:100, после чего 0,5 мл раствора разведения инкубируют с 400 мкл иммуносорбента, отмывают, измеряют сигнал хемлюминесценции.

Определение количества клеток E.coli проводят по калибровочному графику, полученному для стандартных концентраций E.coli (как в примере 1). Количество клеток E.coli, определенное в смеси с клетками Bacillus subtilis соответствует количеству клеток, найденному по стандартному раствору в отсутствии второго микроорганизма.

Оценка эффективности экстракции гемина из микроорганизмов от концентрации Додецилсульфата натрия подтверждается следующими данными:

Таким .образом, использование предлагаемого способа количественного определения микроорганизмов (по сравнению с известным) сокращает время определения с 3-4 ч до 1-1,5 ч, повышает точность анализа за счет определения только целых клеток, а также увеличивает предел обнаружения клеток .

Формула изобретения

Способ количественного определения микроорганизмов путем связывания их со специфическ11ми антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы, отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения точности определения, связанные микроорганизмы обрабатывают ще51290170-6

лочным раствором додецнлсульфата нат- делением его хемлюминесцентным материя в концентрации 10 М, с дом с помощью люминола и перекиси во- последующим выделением гемина и опре- дорода.

Изобретение относится к микробиологии и позволяет сократить время исследования и повысить точность определения микроорганизмов. Анализируемую жидкость смешивают с иммуносор- бентом, инкубируют, сорбент промывают фосфатным буфером. Иммуносорбент со связанными клетками обрабатывают щелочным раствором додецилсульфата натрия в концентрации . Хеми- люминесцентным методом с помощью лю- минола и перекиси водорода определяют выделенный гемин. Количество клеток в образце определяют по калибровочной кривой зависимости интенсивности излучения от содержания клеток в стандартных растворах. i (Л to дЭ