Способ определения амилолитической активности ферментов Советский патент 1987 года по МПК C12Q1/00 C12N9/00 

1129

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промьшшен- ности и может быть использовано для определения амилолитической активности как в готовых ферментных препара- тах, так и в технологическом процессе их производства.

Целью изобретения является повышение точности определения амилолитической активности и сокращение времени анализа.

Сущность способа заключается в том, что для определения амилолитической активности используются низкие концентрации крахмала 0,1-0,15% вместо 2%, что позволяет-при фотомет- рировании применять закон Ламберта- Бутера-Бера, а кроме того, проводят .гидролиз субстрата в течение 15-45 с (против 10 мин). Последний прием позволяет существенно снизить степень гидролиза крахмала. В результате кинетика ферментативной реакции может быть математически описана как кинетика 1 порядка. Таким образом, связь выходного напряжения фотоприемника при фотометрировании окрашенного йодом фермент-субстратного комплекса описывается аналогической формулой

А -|-(1иС„+ - IL.IM

--)

где С - начальная концентрация крахмала, А - активность фермента, К - константа, U и U - напряжение на выходе фотоприемника при заполнении кюветы водой и анализируемым образцом, d - толщина кюветы, К - коэффициент поглощения.

Подробное математическое исследование данной формулы показывает, что при фиксированном времени гидролиза и прочих равных условиях, выходное напряжение фотоприемника в достаточном большом диапазоне линейно связано с актинностью фермента А d( - и). Данное обстоятельство позволяет производить калибровку по двум точкам - сначала фиксируется выходно

напряжение фотоприемника при измере- НИИ с иммитатором фермента с нулевой активностью (дистиллированная вода), а затем напряжение при измерении фермента - с максимальной активностью. Систематическая погрешность за счет нелинейности в этом случае не превышает 3%.. Отношение максимальной к минимальной измеряемой активности при одном разведении может достигать

5

0

5

0

5

0 5

192

величины 16, что определяет существенное преимущество данного способа перед существующими (для которых эта величина равна 2-3), так как практически исключается необходимость повторных измерений из-за ошибок в оценке ожидаемой активности ферментного препарата (и степени его разведения).

Пример 1. В условиях биохимического завода проводят контроль активности амилазы в культуральной жидкости при выращивании Вас.subtilis с помощью предлагаемого способа и сравнивают полученные данные с данными колориметрического способа по ГОСТ 20264.4-74.

Готовят следующие реактивы.

1.0,15%-ный раствор растворимого крахмала. К 0,75 г крахмала (с учетом влажности) добавить 20 мл дистиллированной воды, тщательно перемешать и внести в 300 мл кипящей дистиллированной воды при постоянном переме- лшвании; кипятить в течение 3 мин, затем охладить и перенести в мерную колбу на 500 мл, прибавить 20 мл фосфатного буферного раствора с рН 5,6-5,8, довести объем до метки водой.

2.Фосфатный буферный раствор

(рН 5,6-5,8). 8,32 г однозамещенного фосфорнокислого калия и 1,9 г двуза- мещенного фосфорнокислого натрия растворить в дистиллированной воде, перенести в мерную колбу на 1000 мл и довести водой до метки.

3.Основной раствор йода. 5,5 г кристаллического йода и 11 г калия йодистого растворить в 40 мл дистиллированной воды и довести оръем водой до 250 м,п. Раствор хранить в темной склянке до одного месяца.

4.Рабочий раствор йода. Рабочий раствор йода готовят ежедневно. 20 г калия йодистого растворить в дистиллированной воде, прибавить к нему

2 мл основного раствора йода и обпщй объем довести дистиллированной водой до 500 мл.

Для определения амилолитической активности разбавляют исходную пробу дистиллированной водой в 100 мл или в 500 раз в зависимости от ожидаемой активности, что позволяет определить активность в пределах от 20 до 400 ед/мл. 1 мл раствора фермента смешивают с 2 мл 0,15-ного раствора растворимого крахмала, смесь вьщержи- вают в течение 15-45 с при комнатной

312

температуре, к 1 мл полученного гид- ролизата добавляют 5 мл рабочего раствора йода и окрашенный комплекс фермент-субстрат-йод фотометрируют при длине волны 625 нм, причем в ка- честве показателя светопропускания используют выходное напряжение фотоприемника, а амилолитическую активность определяют по калибровочному графику, построенному в координатах напряжение на выходе фотоприемника- активность, начальную точку которого находят по контрольной пробе. Для определения активности в исходной пробе полученный результат умножают на коэффициент разбавления (100 или 500).

Для построения калибровочного графика берут культуральную жидкость с амилолитической активностью 380 ед/мл определенной с помощью колориметрического метода по ГОСТ 20264.4-74. Из исходной пробы методом разбавления дистиллированной водой готовят растворы с различными активностями и для каждого раствора по предлагаемому способу определяют выходные напряжения фотоприемника. Для точки с нулевой активностью в качестве пробы используют воду. Данные измерений сведены в табл..1 и по ним построен калибровочный график.

При определении.активности препаратов грибного или животного проис- хождения способ измерения и калибровки не изменяется, за исключением того, что используется буферный раствор с другим значением рН (для препаратов грибного происхождения ис- пользуется ацетатный буфер с ,7)

Пример 2. В процессе выращивания культуры Bac.subtilis определяют амилолитическую активность. Отбор проб осуществляют начиная с 20 ч- роста через каждые 4 ч и в конце роста через 2 ч. Пробы разбавляют в 100 и 500 раз, по результатам фото- метрирования определяют напряжение

на выходе фотоприемника и по калиб ровочному графику - активность фермента в разбавленной пробе. Активность фермента в культуральной жидкости определяют путем умножения результата на коэффициент разбавления (100 или 500) .

Результаты измерений сведены в табл. 2.

932

W 5

20 25ЗО,д.

45

50

55

194

Исследование кинетики реакции гидролиза крахмала при его концентрации 0,07, 0,10 и 0,15% (анализ зависимости оптической плотности, в полулогарифмическом масштабе от времени) позволяет сделать следующие выводы.

Начальный участок всех зависимостей является линейным, подтверждая вывод о том, что на данной стадии кинетика ферментативной реакции может быть описана, как кинетика 1-го . порядка.

Увеличение концентрации крахмала сверх 0,15% нецелесообразно, так как в начальной точке оптическая плотность будет превышать величину 2, что приведет к появлению нелинейностей из-за отклонений от закона Ламберга- Бугера-Бера и, следовательно, исказит положение нуля при калибровке методики.

Использование концентраций крахмала ниже 0,10% также нецелесообразно, так как при этом резко сокращается линейный участок, что приводит к значительному сокращению времени гидролиза и появлению больших временных ошибок при выполнении анализа.

Таким образом, оптимальные начальные концентрации крахмала должны лежать в диапазоне от 0,10 до 0,15%. При этом максимальное значение времени гидролиза не должно превьпцать 45 с (т.е. момента отклонения от кинетики 1-го порядка для концентрации крахмала 0,10%). Исходя из этих причин, рекомендуется уменьшать время гидролиза не более, чем в 3 раза по сравнению с максимальным, т.е. до 15 с.

Лабораторные испытания методики показывают высокую производительность выполнения анализов (один анализ с подготовительными операциями занимает не более 2,5 мин в то время, как параллельный анализ по методике ГОСТ 20264.4-74 занимает с под- готовительными операциями и последующими вычислениями по таблицам 25- 30 мин) и хорошую их воспроизводимость (коэффициент вариации при статистической обработке для 10-кратных измерений из одной пробы культуральной жидкости не превьш1ал 2%) .

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет повысить точность определения амилолитической активности (до 2%) и избежать повтор5129

ных определений, характерных для известного способа вследствие необходимости дополнительных разведений, так как соотношение максимальной и минимальной активности при одном разведеНИИ может достигать величины 16 (против 2 - 3 по известному способу). 10-кратное уменьшение времени анализа ускоряет проведение определения. Кроме того, предложенный способ соз- дает основу для автоматизации процесса определения активности амилаз.

Формула изобретения

Способ определения амилолитичес- кой активности ферментов путем сме-

196

шивания пробы с раствором крахмала, проведения гидролиза окрашивания гид- ролизата раствором йода с последующим фотометрированием окрашенного комплекса и расчетом ферментативной активности по калибровочному графику, отличающийся -тем, что, с целью повьшения точности и сокращения времени определения активности, используют раствор крахмала с концентрацией 0,1%-0,15 мас.%, окрашивание пробы раствором йода и фотометрирова- ние осуществляют в момент времени от 15 до 45 с после начала гидролиза.

Таблица 1

Изобретение относится к области анализа активности ферментных препаратов и может быть использовано в микробиологической промьшшенности. Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени определения активности. Сущность способа заключается в нахождении оптимальных концентраций фермент-субстратного комплекса, когда ферментативный гидролиз 6,1С-0,Т5%-ного раствора растворимого крахмала продолжается от 15 до 45 с. Смесь гидролизата и раствора йода фотометрируется при длине волны 625 нм и показателем светопропускания служит выходное напряжение фотоприемника, для чего применяется цифровой электронный вольтметр. Такой прием анализа позволяет определять величину активности в 1 мл раствора препарата от 20 до 400 ед, производя всего лишь одно из двух разведений: в 100 или 500 раз. По результатам выходного напряжения находится величина амилолитической активности по заранее построенному калибровочному графику. Способ прост в исполнении, а также и в его автоматизации, может быть использован в микробиологической промьшшенности и в любой другой, где занимаются анализом активности. «i-амилазы. Применение способа увеличивает точность определения и сокращает время анализа. 2 табл. § (Л to со 00