Способ определения амилолитической активности ферментов Советский патент 1978 года по МПК C12D13/10 C12K1/00 

шейного при его .приготовлении с помощью п-одного раствора йода, и ставятв термостатированное кюветное отделение фотоэлектрокалори.метра (ФЭКа). Барабан ФЭКа устанавливается на оптический ноль. Затем бара-бан уста.навливают в иоложение, соответствующее из-меиению интенсивности окраски опытиой пробы по отношению к контрольной на некоторую величину. Величина эта определяется однажды по кинетической кривой ферментативной реаКЦии (см. пример). Через 5 мин после установки пробирок в измерительный прибор в опытную пробирку наливают 5 мл фер|Ментного раствора, включают секундомер, фиксируют время, по истечении которого стрелка гальванометра ФЭКа переходит через ноль (момент оптического равновесия измерительной схемы). Активность .определяется с ПОМОЩЬЮ калибровочного графика, построеи1ЮГО в координатах время - активность. Калибровочный график строится однажды с использованием раствора фермента, активность .которого измерена калориметричеоким способом (ГО.СТ 20264.4-74). В этом случае активность будет выражена в единицах этого способа.

Пример 1. В УСЛОВИЯ.Х биохимического завода прОБО.дят контроль активиости фер.ментов в .культуральной жидкости при выращивании гриба Aspergillus batatae-61 с помощью пре,длагаемого способа и сравнивают данные с данными калориметрического метода (ГОСТ 20264.4-74).

Первоначально готовят необхо.димые реактивы.

1.2%-ный раствор растворимого крахмала. К 10 г крахмала (с учетом влажности) додагвляют 30 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают и вносят в 300 мл кипящей дистиллированной воды при ПОСТОЯННОМ

-перемещивании. Кипятят 3 мин, затем охлаждают и переносят в мерную колбу на 500 мл, прибавляют 50 мл а цетатного буфера с рН 4,7, доводят объем до метки дистиллированной ВО.ДОЙ.

2.Ацетатный буфериый раствор (рН 4,7).

Ацетатный буферный раствор приготавливается из равных объемов 1 н. раствора уксусной кислоты (58 мл ледяной уксусной кислоты в 1 л) и 1н. раствора уксуснокислого натрия (88 г CHsCOONa в 1 л, р.Н 4,7).

3.Основной раствор йода 5,5 г кристаллического йода (ГОСТ 41-59-64) растворяют в 40 мл дистиллированной воды и доводят его объем водой до 250 мл.

4.Рабочий раствор йода. 20 г йодистого калия растворяют в дистиллированой воде, приба1ВЛ.яют к нему 2 мл основного раствора йода и общий объем доводят дистиллированной водой до 500 мл.

5.Приготовление субстрата. К 500 мл 2%-пого раствора крахмала добавляют 50мл рабочего раствора йо.да. Получают субстрат, имеющий интенсивную синюю окраску.

Для определения аашлолитической активности берут две пробирки (диаметром 2 см и высотой 18 см), паливают .в каждую по 10 мл субстрата и ставят -в термостатированное кюветное отделение фотоэлектрокалориметра

(ФЭКа) в правый и левый световой канал соответственно. Через 5 мин (время, необходимое для .прогрева субстрата до 30° С) левым барабаном ФЭКа устанавливается оптический ноль. Затем правый барабан прибора устанавливается в положение, .соответствующее отсчету 60% по шкале оветопропускания. Величина эта условная, определяется однажды по кинетической кривой ферментативной реакции. После этого в левую иробирку (опыт)

приливают 5 мл рабочего ферментного раствора и включают секундомер, фиксируя время, по истечении которого стрелка гальванометра ФЭКа переходит через ноль (момент оптического равно.весия измерительной схемы). Активность определяется с помощью калибровочного графика, построениого в координатах время - активность.

Для построения калибровочного графика

опре.деляют по 1калориметр.ическому способу амилолитичеокую активность отобранной из фер1ментатора культуральной жидкости. Она равна Л„.х 2,1 ед/мл. Затем с помощью предлагаемого способа при различных разбавлениях культуральной жидкости о.пределяют промежутки времени /, в течение которых светапропуокание опытной пробы изменяется на 40% .по отнощению к контрольной пробе. Учитывая то, что активность фермента в рабочем

(разбавленном в а раз) ферментном растворе .составляет Л.,с;(/а ед/мл, подсчитывают значения Лраб при каждом разбавлении а исходной культуральной жидкости. Затем д.тя некоторых разбавлений (, 18, 27),

совокупность которых позвоЛяет получить взаимно перекрывающиеся диапазоны измерения активности, подсчитывают крайние значения измеряемой активности Л „„„ и J по данным расчета строят калибровочный график.

Результаты .приведены в табл. 1.

Таблица 1

Калибровочный график строится один раз для каждой культуры фер.мента.

IlpHMeip 2. Условность выбора точки фиксации конца измерения позволяет определять амилолитическую активность тогда, когда из-за малой активности исследуемого ферментного материала светопропуокание опытной пробы изменяется не на 40, а на 30% по отношению к контрольной. При этом все операции, связанные с лриготовлением реактивов и проведением испытания, аналогичны оцисанным выше. Однако при построении калибровочного графика определяются промежутки времени t, ,в течение которых светопропускание опытной пробы изменяется на 30% по отношению к контрольной, т. е. при настройке ФЭКА правый барабан устанавливается в положение, соответствуюш,ее отсчету 70% по шкале светопропуокания. В этом случае калибровочный графиК для условий, описанных в примере 1, строится по данным табл. 2, приведенной ниже.

т а б л 1 ц а 2