СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Советский патент 1971 года по МПК C12N9/14 

Изобретение .Относится к технике получения ферментных препаратов, широко применяемых во многих отраслях легкой, пищевой и мясной промышленности.

Известен способ получения комплекса амилол.итических и протеолитических ферментов, заключающийся в выращивании их продуцентов Aspergillus огугаеЗ-9-15 на питательной среде, содержащей солевое питание, и выделении мицелия из культуральной жидкости.

Недостатками известного способа является сложность технологической схемы при выделении ферментных препаратов ИЗ культуральных жидкостей микроорганизмов. Для очистки и концентрирования ферментных растворов и выделения ферментных препаратов приняты такие методы как ионообмен, адсорбция, высаливание и другие.

Для ускорения процесса получения ферментных препаратов по предлагаемому способу в питательную среду вводят молочную сыворотку, при этом для увеличения протеалитической активности в -качестве солевого питания используют карбонат натрия, а для увеличения амилолитической активности бикарбонат натрия.

чатое глубинное культивирование плесневых грибов Aspergillus oryzae 3-9-15.

В первой ступени глубинного культивирования микроорганизмов получают мицелии, которые используют в качестве посевного материала во второй ступени культивирования.

Посевной материал (мицелий) получают следующим образом.

Чистую культуру плесневого гриба Aspergillus oryzae 3-9-15 поддерживают на сусловом агаре (с 1,5-2,5% агара). Посевным материалом служит водная суспензия конидий в количестве 2-4 мл на 100 мл среды (около 22 IQ конидий).

Питательная среда при получении посевного материала (мицелия): 12-25%-ное сусло 80-90%, 5-10%-ная вытяжка из солодовых ростков 10-20%.

Время выращ.ивания посевного материала 20-50 час при 28-30°С.

Основной питательной средой является сыворотка с содержанием 1,5-2,5% карбоната натрия.

Питательные среды стерилизуют при 0,6 ати В течение 30 мин.

Во второй ступени культивирования в основную питательную среду добавляют 3-8% мицелия гриба от объема основной нитательной среды. Культивирование ведут в течение нескольких суток при 28-30°С. Мицелий отфильтровывают или центрифугируют и культуральную жидкость используют без предварительной обработки в качестве ферментного препарата.

Основная питательная среда - молочная сыворотка и соль натрия.

При этом для получения препарата с усиленной протеолитической активностью в качестве соли натрия используют 1,5-2,0% карбоната «атрия, а для получения препарата с повышенной амилолитической активностью 1,5--2,5% бикарбоната натрия.

Протеолитическую активность определяют по модифицированному методу Ансона, применяемому с небольшими изл1енениями.

Активность фермента оценивают по количеству тирозина, содержащегося в продуктах гидролиза, не осаждаемых трлхлоруксусной кислотой. Тирозин определяют по интенсивности окраски, которую эта аминокислота дает с реактивом Фолина.

За единицу фермента (Е) принимают такое количество фермента, которое образует в течение одной м.инуты не осаждаемые трихлоруксусной кислотой продукты протеолиза, содержащие один микроэквивалент тирозина в принятых условиях опыта (время гидролиза 10 мин при 30°С, субстрат 2%-ный раствор казеина в-фосфатном буфере).

Протеолитическая активность (ПА) вЮОлгл культур а льной жидкости определяют по формуле

где ПА - Протеолитическая активность (эквивалент тирозина /100 мл культ, жидк. мин),

а - мкг тирозина, найденное по калибровочной кривой по разности между оптическими плотностями опытной и контрольной проб, 8 - множитель для пересчета количества тирозина на весь объем фильтрата, полученного после осаждения ТХУ,

181 - молекулярный вес тирозина (мкг, 10 - продолжительность протеолиза

(мин), 100 - множитель для пересчета на

IQOмл культуральпой жидкости, Р-разбавление культуральной жид кости перед определением. Метод определения активности всего амилолитического комплекса основан на определении в продуктах ферментативного гидролиза редуцирующих сахароз йодным способом. Проведение анализа.

В колбу на 100 мл вводят пипеткой 10 мл 1%-ного раствора растворимого крахмала. Затем ее помещают на 10 мин s термостат с температурой 30°С. После этого в колбу вводят 1 мл раствора фермента, перемешивают и выдерживают в ультратермостате точно 10 мин. По истечении этого времени реакцию

приостанавливают, добавляя в реакционную смесь 5 мл 0,3 н. раствора едкого калия. Затем в колбу добавляют еще 5 мл 0,1 в. раствора йода, закрывают ее стеклянной пробкой

и выдерживают в течение 20 мин в темном месте.

По истечении этого времени в колбу вводят 2 мл 1 н. раствора соляной кислоты и оттитровывают избыток йода 0,95 к. раствором

гипосульфита.

Одновременно проводят контрольный опыт для определения редуцирующих Сахаров Б субстрате и в растворе фермента. Для этой цели в колбу вводят 10 мл субстрата, 5 мл

0,3 н. раствора и 5 мл 0,1 н., раствора йода. Ход дальнейшего анализа совпадает с вышеприведенным.

За единицу фермента (Е) принимают такое количество фермента, которое расщепляет в

течение 1 мин один микроэквивалент гликозидных связей в крахмале в принятых условиях опыта.

Ам-илолитическая активность в 1 мл культуральной жидкости определяется по формуле

ДА (ai-aa)-25.P

10

где АА--амилолитическаяактивность

(микроэквивалент гликозидных связей /1 мл

культ, жидк. мин.); ai - количество 0,05 w. раствора гипосульфита, ущедшего на титрование контрольной пробы (мл); QZ - объем 0,05 н. раствора гипосульфита, ушедш гго на титрование опытной пробы (мл); 25 - количество гликозидных связей, соответствующее 1 мл 0,05 н. раствора гипосульфита (в мк эквивалентах); Р - разбавление культуральной жидкости перед определением. За единицу амилолитической активности

(АА) принято количество фермента, которое в определенных условиях (рН 4, 7, t 30°С, концентрация крахмала 1%) за одну минуту катализирует гидролиз 1 микроэквивалбнта гликозидных связей.

Пример. Питательную среду (25%-ное сусло 90%, 10%-ная вытяжка из солодовых ростков 10%) для получения посевного материала после стерилизации при 0,6 ати в течение 30 мин и охлаждения засевают водной

суспензией конидий культуры Aspergillus oryzae 3-9-15 в количестве 4 мл (20-10° конидий). Время выращивания посевного материала 24 час нр.и 30°С. Культивирование ведут па качалке с 130 об1мин в конических колбах емкостью 500 мл с содержанием питательной среды 100 мл. Осповной питательной средой является сыворотка с добавкой 2% карбоната натрия. После стерилизации при 0,6 ати в течение 30 мин и охлаждения в основную питательную среду добавляют 5% мицелия от объема основной питательной среды. Культивирование гриба ведут в течение 48 час при 30°С на качалке с 280 об/мин в конических колбах емкостью 500 мл с содергриба отфильтровывают. Протеолитическая активность культуральиой жидкости 20 Е/мл. Культуральную жидкость (2% от веса мяса) используют в качестве препарата для улучшения качества мяса, а именно ускорения его созревания и размягчения.

При производстве ферментного препарата с повышенной амилол.итической активностью основной питательной средой является сыворотка с добавкой 2% бикарбоната натрия.

В охлажденную стерилизованную питательную среду добавляют 5% посевного материала.

Культивирование гриба ведут в течение 5 суток нри 30°С на качалке с 280 об/мин в конических колбах емкостью 500 мл с содержанием л.итательиой среды 100 мл. Мицелий гриба отфильтровывают.

Амилолитическая активность культуральной жидкости 50 Е/мл. Культуральную жидкость используют в качестве препарата для улучшения качества пшеничного хлеба.

При добавлении культуральной жидкости в

тесто ускоряется процесс брожения теста, повышается пористость хлеба на 8% и удельный объем на 20%, улучшаются вкусовые качества и аромат хлеба.

Предмет изобретения

1.Способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов путем

вырашивания их продуцентов Aspergillus oryzae 3-9-15 на питательной, среде, содержашей солевое питание с последуюшим выделением мицелия из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью ускорения

процесса, в питательную среду вводят молочную сыворотку, при этом для увеличения протеолитической активности в качестве солевого питания используют карбонат натрия, а для увеличения амилолитической активности - бикарбонат «атрия.

2.Способ но п. 1, отличающийся тем, что карбонат и бикарбонат натрия используют в количестве 1,5-2,5%.