Способ определения активности холинэстеразы Советский патент 1992 года по МПК G01N27/333 

Изобретение относится к способам определения активности ферментов, конкретно к электрохимическому способу определения активности холинэстеразы путем измерения тока, и может быть использовано в промышленности для обнаружения холинэстеразы в средах их выращивания, в мониторинге окружающей среды при установлении ингибиторов холинэстеразы, например токсических фосфорорганических соединений, а также для клинических исследований в диагностических целях.

Известен способ определения холинэ- стеразной активности, включающий гидролиз субстрата производного п-гидроксибензоил- холина под действием холинэстеразы с образованием п-гидроксибензойной кислоты, реакцию последней с ферментом гидролазой п-гидроксибензойной кислоты в присутствии кофермента никотинамидадениндинуклеотидфосфата в восстановленной форме (НАДФН). При этом НАДФН окисляется до никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ). Об активности фермента холинэстеразы судят или по величине уменьшения экстинкции, или по степени потребления кислорода при превращении НАДФН в НАДФ.

Недостатком этого способа является применение дополнительного фермента и /других дорогостоящих реагентов, таких как НАДФН.

Известен спектрофотометрический способ определения активности холинэстеразы, заключающийся в том, что проводят гидролиз субстрата бутирилтиохолина под действием холинэстеразы в присутствии голубого красителя - 2,6-дихлорфенолиндо- фенола. Бутирилтиохолин при гидролизе высвобождает тиохолин, который непосредXIГО 00 XI XI О

ственно восстанавливает этот краситель, переводя его в бесцветную форму. Изменение поглощения при 600 нм, обусловленное исчезновением 2,6-дихлорфенолиндофено- ла, прямо пропорционально активности хо- линэстеразы.

Недостатками способа являются необходимость применения оптически прозрачных проб, длительность способа из-за того, что приготовленные растворы не подлежат хранению, а применяемый реагент 2,6-дих- лорфенолиндофенол является канцерогенным веществом,

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности холи- нэстеразы, включающий приготовление реакционной смеси, содержащей калий- фосфатный буфер рН 7,5 и субстрат - аце- тилхолин, помещение ее в электрохимическую ячейку, снабженную рабочим электродом из платины, предварительно химически модифицированной с помощью холиноксидазы (К.Ф. 1.1.3,17), и электродом сравнения, в качестве которого используют насыщенный каломельный электрод, дальнейшее введение в ячейку холинэстеразы, проведение электролиза при потенциале 0,8 В, измерение тока и определение активности холинэстеразы по увеличению анодного тока. Относительное стандартное отклонение состав- ляет ±1,8%.

Ферментный электрод готовят следующим образом. Платиновую сетку (1x2 см) анодируют 1 ч при потенциале 2,5 В отн. н.к.э. в 0,1 М серной кислоте, кипятят 5 ч с 3-аминопропилтриэтоксисиланом в толуоле и отмывают. На одну сторону обработанной Pt сетки наносят 6 мкл 20%-ного раствора альбумина, 8 мкл 4%-ной холиноксидэзы в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,0, 4 мкл 4%- ного глутарового альдегида и выдерживают в открытом воздухе 12 ч. Стабильность ферментного электрода 2 мес.

Недостатками способа являются использование драгоценной платины, допол- нительного второго фермента холиноксидазы и белка - альбумина, а также длительность процесса из-за трудоемкой обработки платиновой сетки, Способ требует сложной аппаратуры и специаль- ных реагентов: 3-аминопропилтриэтоксиси- лан и токсичный глутзровый альдегид.

Целью изобретения является увеличение экспрессное™ определения и удешевление процесса.

Способ реализуется с использованием графитового электрода, изготовленного из стержня спектрально чистого графита. К одному концу стержня длиной 3-6 мм при помощи серебряного эпоксидного клея

приклеивают медную проволоку, другой конец шлифуют наждачной бумагой.(-250 мкм) и на нем адсорбируют модификатор. Электрод впрессовывается в тефлоновый корпус.

В качестве низкомолекулярного ре- докс-соединения для модификации электрода используют, например, тетраци- ано-п-хинодиметан (ТЦХМ).

Сущность способа объясняется схемой ферментативной реакции с образованием тиохолинхлорида нт, -.-..

ГХЭ

С3К7 COSCfyCHrM HjCf--

с н3

ЙН3 - С3Н7СООН+НЗ-СНгСНг-К+СНзСГ

СН3

Образовавшийся тиохолинхлорид реагирует с окисленной формой адсорбированного на графитовом электроде модификатора - (Мох) с образованием восстановительной формы (Мвос). Последняя окисляется электрохимически при потенциалах редокс-преMoxtZRSH- MBOC4RS)2

вращения:

MBOG ....

При электрохимическом окислении модификатора генерируется анодный ток. Скорость увеличения анодного тока пропорциональна активности холинэстеразы.

Пример 1. Определение зависимости скорости увеличения анодного тока dl/dt от концентрации холинэстеразы.

Электрод (диаметром 5,9 мм) модифицируют путем нанесения на поверхность 40 мкл раствора ТЦХМ в толуоле (6 мг/мл). Растворитель упаривают в воздухе в течение 2 ч. После модификации электрод погружают в термостатированную при температуре 25°С стеклянную ячейку с 20 мл 0,1 М калий- фосфатного буферного раствора рН 7,0, с помощью полярографа ОН 105 по 3-элек- тродной схеме определяют остаточный ток. В качестве рабочего электрода используют модифицированный вращающийся графитовый электрод, электродом сравнения служит насыщенный каломельный электрод, вспомогательный - Pt пластина. В раствор вводится 50 мкл раствора бутирилтиохолин- хлорида. Уровень стационарного тока почти не изменяется. В ячейку вводится 10 мкл раствора холинэстеразы (К.Ф. 3.1.1.8, Перм-.

ский НИИ вакцин и сыворотки). Наблюдают увеличение анодного тока.

Зависимость скорости увеличения тока от концентрации фермента приведена в табл.1.

Потенциал ,15 В отн. н.к.э., скорость вращения электрода и 325 об/мин, . Концентрация бутирилтиохолинхлр- рида 50 мкМ.

Аналогично проводят измерения при ско- рости вращения электрода об/мин. Установлено, что результаты измерений не меняются, поэтому определения для всех концентраций фермента проводят при одинаковых скоростях.

Как видно из табл. 1, линейность зависимости dl/dt от концентрации фермента наблюдается от 0 до 4,5 ед/мл. При больших концентрациях прямая зависимости dl/dt от концентрации холинэстеразы загибает- ся. Коэффициент корреляции прямой 0,9997, стандартное отклонение 0,021 мкА. Чувствительность метода начинается с концентрации фермента 0,045 ед/мл.

П р и ме р 2. Определение зависимости скорости увеличения анодного тока от концентрации бутирилтиохолинхлорида (БТХХ).

Электрод изготавливается как в примере 1. Определяется зависимость dl/dt от концентрации БТХХ (табл.2). Потенциал 0,15 В отн. нж.э., ш 325 об/мин, 0,1 М калий-фосфатный буферный раствор рН 8,0, . Концентрация холинэстеразы 4,5 ед/мл.

Как видно из табл.2, линейность зависимости dl/dt от концентрации бутирилтиохолинхлорида наблюдается в интервале от О до 100 мкм. При больших концентрациях калибровочная прямая загибается. Стан- дартное отклонение в линейном участке прямой составляет 0,02 мкА, коэффициент корреляции 0,9917.

Пример 3. Электрод изготавливается как в примере 1. Проводится калибровка электрода по отношению к тиохолину при разных потенциалах электрода. Для этого определяется остаточный ток 0,1 М калий- фосфатного буферного раствора и вводится 50 мкл раствора тиохолина в том же буфере. В течение 30 с устанавливается новый стационарный уровень анодного тока.

Зависимость остаточного тока 0ст и тока электрода I от потенциала электрода приведены в табл.3.

Концентрация тиохолина 100 мкМ, Другие условия как в примере 1.

Как видно из табл.3, в интервале от 0,3 до-0,1 В практически можно провести измерения, но оптимальные условия обеспечиваются при потенциале OJ5-0.05 В отн. н.к.э., поскольку отношение между током электрода и остаточным током S/N наибольшее при этих значениях потенциала. Ниже указанного предела (т.е. - 0,2 В) не наблюдается окисление тиолов, а при потенциале более 0,2 В значительно вырастает остаточный ток, обусловленный побочными электрохимическими превращениям на рабочем электроде.

Пример 4. Определение активности холинэстеразы. Берут2 мг/мл исследуемого фермента в буферном растворе. Электрод изготавливается как в примере 1. Затем в 0,1 М калий-фосфатный буферный раствор рН 8,0 в присутствии 0,2 мМ бутирилтиохолинхлорида вводят разные объемы раствора холинэстеразы и записывают кинетические кривые изменения тока.

Для вычисления скорости ферментативной реакции устанавливают величину тока при использовании стандартного раствора тиохолина -0,4 мМ, которая равна 0,220 мкА. При введении в ячейку 10 мкл (20 мкг) исследуемого раствора холинэстеразы изменение тока составляет 0,224 мкА/мин. Тогда скорость ферментативной реакции вычисляется следующим образом: 400 мкМ - 0,22 мкА, х - 0,224 мкА/мин, х 407,3 мкМ/мин (в 1 л) или 8,14 мкМ/мин в ячейке 20 мл. Активность фермента вычисляется по формуле

А, ед/мл К щ2 ,

где К- коэффициент, равный концентрации тиохолина, мкМ, которая способствует изменению тока в ячейке 1 мкА;

а - измеренное изменение тока, мкА/мин;. .

b - степень разбавления исследуемого образца.

Например, при введении в ячейку 10 мкл исследуемой холинэстеразы получают

., 400мкМ 1Я1Я-0 ,22мкА 1818 2

,

,224 мкА/мин,

А, ед/мл 814,5.

Поскольку исследуемый образец содержал 2 мг/мл белка, то удельная активность

А, Е .,3

Аналогично вычислены и другие скорости ферментативной реакции и активности. Данные приведены в табл.4.

Из табл.4 видно, что наблюдается строгая прямолинейность увеличения тока dl/dt от активности холинэстеразы. Вычисленные из любой точки активности препарата близки (среднее 404,2 Е/мг белка). Относительное стандартное отклонение 1,26% (в известном способе 1,8%). Вычисленная удельная активность из построенного калибровочного графика (скорость реакции - количество холинэстеразы) составляет 410 Е/мг, т.е. практически совпадает.

Преимуществом способа является упрощение и удешевление за счет исключения трудоемкой обработки рабочего электрода и применения второго фермента холинокси- дазы, белка - альбумина и 3-аминопропилт- риэтоксисилана. Уменьшается токсичность способа, так как исключается применение глутарового альдегида. Метод более экспрессивен - в 8 раз сокращается время при- готовления электрода (для приготовления модифицированного графитового электрода требуется 2 ч, а для приготовления Pt электрода - 16 ч). Повышается точность определения в 1,4 раза (относительное откло- нение в предлагаемом способе не превышает 1.26%, а в известном - 1.8%).

Формула изобретения

1.Способ определения активности холинэстеразы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей 0,1 М калий-фосфатный буферный раствор и субстрат, введение ее в электрохимическую ячейку, снабженную рабочим электродом и насыщенным каломельным электродом, введение в ячейку исследуемого вещества, проведение электролиза с последующим определением искомой величины, отличающийся тем, что, с целью увеличения экспрессности определения и удешевления способа, в качестве субстрата использован бутирилтиохолинхлорид, в качестве рабочего электрода использован графитовый электрод, химически модифицированный низкомолекулярными редокс-соединения- ми, электролиз проводят при потенциале 0,15-0,05 В отн. н.к.э., а активность холинэстеразы определяют по скорости увеличения анодного тока.

2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве низкомолекулярного ре- докс-соединения использован тетрациано п-хинодиметан.

Изобретение относится к способам определения активности холинэстеразы путем электролиза исследуемого вещества в присутствии субстрата. Повышение экспресс- ности и удешевление процесса достигаются при использовании графитового электрода, модифицированного низкомолекулярными редокс-соединениями, например тетрациа- но-п-хинодиметаном, а в качестве субстрата - бутирилтиохолинхлорида. Электролиз ведется в 0,1 М калий-фосфатном буферном растворе, рН 8,0. Активность холинэстеразы определяется по скорости увеличения анодного тока. В результате можно определить активность холинэстеразы в интервале концентраций 0,045-4,5 ед/мл. 1 з.п. ф-лы, 4 табл. Ё

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4