Способ получения противогриппозных антител Советский патент 1987 года по МПК A61K39/12 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для производства диагностических и лечебных сывороток.

Цель изобретения - пролонгирование повьтенных титров антител.

Пример 1. Для получения ви- русосодержащей жидкости используют 10-1 -дневные куриные эмбрионы, в аллантоисную полость которых вводят по 0, аллантоисной культуры вируса гриппа А (Гонконг/1)68(Н3112) в разведении 10 -Ю , Эмбрионы после заражения инкубируют 48 ч в термостате при Зб-ЗВ С, По истечении срока инкубации эмбрионы охлаждают 1В ч при и°С или 2-3 ч при . Аллантоисную жидкость из зараженных куриных эмбрионов отсасьшают и исследуют в реакции гемагглютинацни с 1%-ной взвесью эритроцитов кур. Для этого, готовят двукратные падающие разведения вируса на физиологическом растворе хлористого натрия в объеме 0,2 мл и после этого в каждое разведение добавляют по 0,2 мл 0,1%-ной взвеси эритроцитов кур,- Реакцию Ведут при комнатной температуре и учитьшают после полного оседания эритроцитов. За титр вируса принимают наибольшие разведения, дающие четко выраженную агглютинацию,

Аллантоисную вирусосодержащую жидкость центрифугируют на холоду в центрифуге ЦЛР-1 при 5000 об/мин 20 мин для удаления механических примесей. Осадок отбрасывают, а над- осадок центрифугируют на холоду в , центрифуге ЦВР-1 при 20000 об/мин IjS ч, чем достигают концентрирование вируса, надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендлруют в охлажденном физиологическом растворе и разводят до титра 1:8000-1: :16000 ГА/0,2 мл.

Очистку вирус ной суспензии проводят методом фильтрационной хроматографии на колонках с макропористым силохромом (ШС) .

Колонку с ШС (16 см « 2 см) промывают 0,05 М трис-НС1-буфером (три- -оксиметил-аминометан) на 0,15 М растворе хлористого натрия (рН буфера 7,2-7,4) до тех пор пока выходящая из колонки жидкость не соответствует этому значению рН. Уровень буфера в колонке уравнивают по нижнему мениску с уровнем МПС. Ви

5

0

5

русную суспензию тщательно пипетиру- ют, центрифугируют на холоду при 2000 об/мин и надосадок вносят в колонку из расчета 1/4-1/5 объема столба Ж1С, После того, как вирусная суспензия входит в МПС, в колонку вносят буфер и при скорости 0,6 МП/см /мин собирают элюаты в мерные пробирки по 2 мл, В каждом элюате определяют титр вируса, Элюаты с высоким содержанием гемагглю- тинирующей активности объединяют с учетом, что объем смеси элюатов не превьпяает-1/4-1/5 объема столба МПС, Таким образом, получают необходимый объем очищенной вирусной суспензии и определяют титр вируса, который, как правило, не отличается

от титра вирусной суспензии до очистки.

Очищенную суспензию ин- активируют ультрафиолетовым облучением лампой БУФ-30 на расстоянии 17 см 30 мин при периодическом перемешивании.

Очищенный инактивированный вирус с титром 1:8000 ГА/0,2 мл совместно (в одном шприце) с 2,7 мг трипсина и 5,4 мг поливинилового спирта (весовое соотношение трипсин:поливиниловый спирт 1:2) в объеме 1 мл 0,15 М раствора хлористого натрия вводят подкожно (в область задней конечности) однократно бельм беспородным крысам массой 150-200 г.

Лабораторным животным контрольной группы вводили соответствующзто дозу вируса с максимальным количеством поливинилового спирта.

Каждая группа состоит из семи ла- бораторных животных. В день иммунизации и затем на 14, 28, 35 и 42 дни производят забор крови из хвостовой вены крыс. В полученных из крови сьшоротках определяют антигемагглю- тинирующую активность в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Перед постановкой РТГА для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации сьшоротки обрабатьтают риванолом. Для этого к 0,1 мл сыворотки добавляют 0,4 мл 0,4%-ного раствора риванола (рН 7,-2-7,4), встряхивают и оставляют на 20 мин при 4°С. Вы- павший осадок удаляют центрифугированием при 1500 об/мин 10 мин. К надосадочной жидкости добавляют хлористый натрий из расчета 20 мг на пробу и помещают на 18 ч в-холодиль0

5

0

5

0

ник. Надосадочную жидкость после центрифугирования используют для постановки РТГА, для чего применяют микротитратор Такат,

Двукратное разведение сыворотки с

готовят на 0,15 М растворе хлористо- го натрия перекаткой петлями объемом

0,025 мл. Рабочее разведение одноименного вируса А(Гонконг/1)68 содержит четыре гемагглютинирующие еди-fo ницы. К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем рабочего разведения вируса. Смесь встряхивают и 30 мин выдерживают при комнатной температуре, а затем в лунки добавля-15 т двойной объем 0,5%-ной взвеси куриных эритроцитов. Из полученных результатов рассчитьшают средние гео- , метрические титры антител и достоверность различий. Они свидетельству-2о 28, 35, 42 дни наблюдения титры анют о том, что в более поздние сроки наблюдения (на 28-42 дни) средние геометрические значения антигемаг- глютинирующей активности в опытной группе в 2, 8, 7, 5 раз вьш1е, чем при известном способе.

П р и м е р 2. Последовательность выполнения операций аналогична примеру 1 . Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:поливиниловый спирт 2,7 мг:54 мг (1:20). При этом титр антиг емагглютининов на 28-42 дни в опытной группе в 3,2-9,2 раз вьше, чем при известном способе. П р и м е р 3. Последовательность выполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:поливиниловый спирт 2,7 мг:4,05 мг (1:1,5). Увеличивать количество поливинилового спирта больше соотношения 1:20 нецелесообразно, из-за вязкости образующегося раствора.

П р и м е р 4. Последовательность вьшолнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при использовании поливинилпирролидона. Весовое соотношение трипсин:поли- винилпирролидон 2,7 мг:5,4 мг (1:2). Титры антигемагглютининов на 28- 42 дни в опытной группе в 2,6- 10,6 раз вьапе, чем при известном способе.

П р и м е р 5. Последовательность выполнения операций аналогична примеру 1. Осуществляют способ при использовании поливинилпирролидона. Весовое соотношение трипсин:поли- винилпирролидон 2,7 мг:54 мг (1:20).

25

30

35

40

45

50

55

тигемагглютининов в опытной группе соответственно в 2,6-10,6 раз зьш1е чем при известном способе.

П р и м е р 8. Последовательность вьшолнения операций аналогична примеру 1, Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:полиэти- ленгликоль 2,7 мг:54 мг (1:20). На 28, 35, 42 дни наблюдения титры антигемагглютининов в опытной группе соответственно в 3, 12, 1 раз вьш1е , чем при известном способе.

П р и м е р 9. Последовательность :выполнения операций аналогична примеру 1. Невозможно осуществлять способ при весовом соотношении трипсин :полиэтиленгликоль 2,7 мг:4,П5 мг (1:1,5).

Увеличивать количество полиэтиленгликоля больше нецелесообразно из-за увеличения вязкости раствора.

Таким образом, предлагаемый способ получения противогриппозных антител позволяет повысить титры специфических антител в сыворотках крови животных-продуцентов в.2-12 раз, причем на более длительных Сроках после иммунизации (28-42 дни) наблюдается увеличет{ие титров антител в 3-12 раз. Это лозволяет увеличить сроки использования животных и при этом получать более высокотитражные сыворотки, и может быть использовано для производства диагностических и лечебных препаратов, а также в практике научных исследований.

При этом титры антигр.магглютини- нов на 21-42 дни в 2,5-5,7 раз выше, чем при известном способе.

Пример 6. Последовательность вьтолнения операций аналогична примеру 1-. Невозможно осуществлять способ при весовом соотношении трипсин: :поливинилпирролидон 2,7 мг:4,05 мг (1:1,5).

Увеличивать количество поливи- нилпирролидона больше соотношения 1:20 нецелесообразно из-за вязкости образующегося раствора.

П р и м е р -7. Последовательность выполнения операций аналогична при- |Меру 1 . Осуществляют способ при ис- пользовании полиэтиленгликоля. Весовое соотношение трипсин:полиэтилен- гликоль 2,7 мг:5,4 мг (1:2). На

5

0

5

0

5

0

5

тигемагглютининов в опытной группе соответственно в 2,6-10,6 раз зьш1е, чем при известном способе.

П р и м е р 8. Последовательность вьшолнения операций аналогична примеру 1, Осуществляют способ при весовом соотношении трипсин:полиэти- ленгликоль 2,7 мг:54 мг (1:20). На 28, 35, 42 дни наблюдения титры антигемагглютининов в опытной группе соответственно в 3, 12, 1 раз вьш1е , чем при известном способе.

П р и м е р 9. Последовательность :выполнения операций аналогична примеру 1. Невозможно осуществлять способ при весовом соотношении трипсин :полиэтиленгликоль 2,7 мг:4,П5 мг (1:1,5).

Увеличивать количество полиэтиленгликоля больше нецелесообразно из-за увеличения вязкости раствора.

Таким образом, предлагаемый способ получения противогриппозных антител позволяет повысить титры специфических антител в сыворотках крови животных-продуцентов в.2-12 раз, причем на более длительных Сроках после иммунизации (28-42 дни) наблюдается увеличет{ие титров антител в 3-12 раз. Это лозволяет увеличить сроки использования животных и при этом получать более высокотитражные сыворотки, и может быть использовано для производства диагностических и лечебных препаратов, а также в практике научных исследований.

5 1301409, 6

Формула изобретенияс раствором, содержащим трипсин и

I, Способ получения противогрип- водорастворимый полимер при весовом

позных антител путем иммунизации жи-соотношении соответственно 1:2-1:20.

нотных инактивированным вирусом.2, Способ по п. 1, о т л и ч агриппа, отличающийся ю щ и и с. я тем, что в качестве

тем, что, с целью .пролонгированияводорастворимого полимера используповышенных титров антител, иммуни-ют поливиниловый спирт, поливинилзацию вирусом осуществляют совместнопирролидон или полиэтиленгликоль.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, предназначено для производства диагностических и лечебных сывороток. Цепь изобретения - пролонгирование повышенных титров антител. Для этого получают вирусо- содержащую жидкость, используя 10- 1 -дневные куриные эмбрионы, в ал- лантоисную полость которых вводят аллантоисную культуру вируса гриппа А (Гонконг/1)68(Н3112). Аллантоис- нук) вирусосодержап;ую жидкость центрифугируют на холоду при 5000 об/мин 20 мин для удаления механических примесей. Очистку вирусной, сусцен- зии ведут методом фильтрационной хроматографии на колонках с макропористым силохромом. Очищенную вирусную суспензию инактивируют ультрафиолетовым облучением. Очищенный инактивируемый вирус с титром Г: :800 ГА/0,2 мл совместно, в одном шприце с трипсином и поливиниловым спиртом (массовое соотношение трипсина и поливинилового спирта 1:2- 1:20) в объеме 0,15 М раствора хлористого натрия вводят подкожно лабораторным животным, В полученных из их крови сыворотках .определяют анти- гемагглютинирующую активность в реакции торможения гемагглютинации. Предлагаемьй способ позволяет повысить титры специфических антител в сыворотках крови животных-продуцентов в 2-12 раз, при этом увеличиваются сроки использования живртньгх, получают более высокотитражные сыворотки, которые используют для производства диагностических и лечебных препаратов, 1 з.п. ф-лы. Q (О (Л со о 4 О СО