Способ определения цистеин-содержащих белков Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения цистеинсодержащих белков при электрофорезе в полиакриламидном геле.

Цель изобретения - упрощение спо соба за счет сокращения числа стадий

Способ осуществляется следующим образом.

Анализируемые белки разделяют диск-электрофорезом в полиакриламидном геле, затем гели извлекают из трубок и погружают на 8-12 мин в 6,9-10,9%-ный раствор плюмбита калия после чего в том же,растворе инкубируют 8-12 мин на кипящей водяной бане. При этом в зонах цистеинсодержащих белков проявляются ерные полосы сульфида свинца. Для фиксации окраски и сохранения структуры гелей их выдерживают 12-18 мин в 5-10%-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин. Через 24 ч глицерин необходимо сменить. Для длительного сохранения окраски гели хранят в герметически закрытой посуде в глицерине в прохладном темном месте.

П р и м е р 1 . Приготовление аналитического реагента для идентификации цистеинсодержащих белков - раствора плюмбита калия,

К 10%-ному раствору ацетата свинца постепенно приливают приперемешивании насыщенный раствор едкой щелочи (кон). При этом выпадает белый осадок гидроокиси свинца. Щелочь приливают до полного растворения осадка. Вместо ацетата свинца можно использовать другие растворимые в воде соли свинца, а вместо едкого калия - едкий натр.

Идентификация индивидуального цис теинсодержащего белка, а именно сывороточного альбумина быка, при разделении диск-электрофорезом в полиакриламидном геле.

5 мкл водного раствора, содержащего 10 мкг сывороточного альбумина быка, подвергают диск-электрофорезу в 7,5%-ном полиакриламидном геле. Для диск-электрофореза используют стеклянные трубки с внутренним диаметром 3 мм и длиной 70 мм. После диск-электрофореза гели извлекают из трубок и помещают в раствор плюмбита калия на 10 мин при комнатной температуре, затем в том же растворе гели инкубируют 10 мин на кипящей водяной

5

0

5

0

5

0

5

0

5

бане, ополаскивают дистиллированной водой, выдерживают 15 мин в 7%-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин. При этом в гелях появляются черные полосы в зонах альбумина и его димера. Гели денситометрируют в проходящем свете на микроденситометре.

Построение калибровочной кривой.

Для определения количества цистеи- на в зонах цистеинсодержащих белков строят калибровочную кривую по сывороточному альбумину быка. Для этого подвергают диск-электрофорезу образцы, содержащие соответственно 10,20, 40,60,80 и 100 мкг сывороточного альбумина быка. После диск-электрофореза гели обрабатывают, как описано. После денситометрирования гелей ден- ситограммы вырезают и обрабатывают гравиметрически. Зная количество альбумина в образцах и содержание в альбумине цистеина (5,17%), строят калибровочную кривую, отражающую зависимость массы денситограмм от количества цистеина в зоне. По калибровочной кривой можно определить количество цистеина в зонах цистеинсодержащих белков, а также количество самих белков, если известно содержание в них цистеина.

П р и м е р 2. Индентификация цистеинсодержащих белков сыворотки крови крыс при диск-электрофоррзе в полиакриламидном геле.

5 мкл сыворотки крови крыс подвергают диск-электрофорезу в 7,5%-ном полиакриламидном геле. После диск-электрофореза гели обрабатывают, как описано. После денситометрирования гелей денситограммы вырезают и обрабатывают гравиметрически. Цистеинсодержащие белки индентифици- руют в зонах альбумина, гемоглобина и иммуноглобулинов в виде интенсивных черных полос. По весу денситограмм при помощи калибровочной кривой определяют содержание цистеина в зонах и количество альбумина в образце.

В таблице представлены данные, отражающие содержание цистеина в зонах цистеинсодержащих белков сыворотки крови крыс.

Согласно получершым данным содержание мономерной формы альбумина в 5 мкл сыворотки крови крыс составляет 42 мкг или 840 мг%.

9,2

.

2,12

| ,4

0,52

Масса белка в зонах, мкг

42

П р и м е р 3. Определение оптимальных режимов обработки гелей.

Оптимальный диапазон концентраций плюмбита калия в растворе составляет 6,9-10,9%. Масса площади пика денси- тограммы для зоны альбумина,нанесенного в количестве 40 мкг на гель при обработке раствором плюмбита калия в концентрациях .6,9; 8,6 и 10,9% составляет соответственно 9,2±18; 9,0+0,20; 9,1+0,23 мг.

Вьздерживание геля в растворе плюмбита калия при 25 С оптимально в течение 8-12 мин. Масса площади пика на денситограмме (40 мкг альбумина на гель) при, инкубации геля в течеСоставитель Н. Гуляева Редактор О. Юрковецкая Техред И.Попович . Корректоре. Шекмар

Заказ 1212/44Тираж 777 Подписное

ВНИШ1И Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

10

15

20 , 25

30 954

ние 8,10 и 12 мин при 25°С составляет соответственно 7,0+0,12; 7,0+0,14 и 7,1+0,15 мг (значения при отсутствии дальнейшего выдерживания на кипящей водяной бане).

Вьщерживание геля в растворе плюмбита калия при кипячении на водяной бане оптимально в течение 8-12 мин. Масса площади пика на денситограмме (для 40 мкг альбумина на гель) при инкубации геля в течение 8, 10 и 12 мин при кипячении на водяной бане составляет соответственно 9,0+0,2; 9,1+0,2 и 9,f+O,25 мг.

Формула изобретения

Способ определения цистеинсодержа- щих белков путем разделения анализируемых белков диск-электрофорезом в полиакриламидном геле с последующей обработкой геля окрашивающим реагентом и денситометрированием, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа стадий, в качестве реагента используют плюмбит калия в концентрации 6,9-10,9%,выдерживают гель в этом растворе 8-12 мин, а затем 8- 12 мин на кипящей водяной бане.

Для упрощения способа белки разделяют диск-электрофорезом в поли- акриламидном геле, затем гели погружают на 8-12 мин в 6,9-10,9%-ный раствор плюмбита калия и инкубируют в том же растворе 8-12 мин на кипящей водяной бане. Для фиксации окраски и сохранения структуры гелей их в.ьщер- живают 12-18 мин в 5-10%-ной уксусной кислоте и помещают в глицерин. Гели денситометрируют в проходящем свете. 1 табл. оо о ю со СП