Способ определения гидрофобности белков Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области

физико-химической биологии и битехно- логии, а именно к биологической и аналитической химии, и может быть использовано научными учреждениями - для изучения структуры, физико-хими- ческих, функциональных свойств био- полимеров и природных соединений.

Целью изобретения является усиле- Q ние разрешающей способности и повьше- ние точности анализа при исследова- НИИ физико-химических и функциональных свойств белков.

Способ заключается в том, что про-15 водят разделение гетерогенного белка на фракции методом электрофореза в полиакриламидном геле с одновременным концентрированием фракций в небольшом объеме. Гидрофобность20

компонентов гетерогенного белка определяют после их денатурации три- хлоруксусной КИ.СЛОТОЙ в геле путем окрашивания метиленовым голубым после обработки детергентом - додецил- 25 сульфатом натрия.

При мер. Препарат зеина, полученного из зндосперма кукурузы, в количестве 200-300 мкг наносят на каждую из трех дорожек и подвергают зо электрофоретическому разделению в пса1и акрил ами дном геле.

Пластину геля помещают для денатурации разделенных белковых компонентов зеина в 10%-ньй раствор трихлор- уксусной кислоты на 1 ч. Затем раствор кислоты сливают и операцию повторяют еще раз. Одну из дорожек вырезают из пластины и окрашиванхг 0,05%- ным раствором кумасси R-250 в тече- д ние 90 мин, отмывают дорожку от избытка красителя дистиллированной водой и интенсивность окраски белковых компонентов определяют денсито- метрически (вариант в).,

Пластину геля с оставшимися двумя дорожками обрабатывают 0,02 М натрий- фосфатным буфером рН 7,0 в течение 1 ч. Раствор смывают и операцию повторяют до тех пор пока рН промывного г буфера не достигнет нейтрального значения.

Дорожки отделяют друг от друга и одну из них окрашивают 0,002-0,004%-- ным раствором метиленового голубого в течение 2 ч После итого гель отмывают от избытка красителя дистиллированной водой и определяют интен

Q

15 20

25

зо

д ,

5

сивность окраски белковых компонентов денситометрически (вариант б),

Другую дорожку обрабатывают 0,14- 0,20 мМ додецилсульфата натрия в течение 2 ч. Затем освобождают гель от избытка детергента промывкой натрий- Фосфатным буфером рН 7,0 (пять раз по 1 ч) и гель окрашивают так же, как и в варианте б, и проводят ден- ситометрию (вариант а).

Все операция с гелями проводят на качалке при .постоянном режиме встряхивания и комнатной температуре.

Расчет гидрофобности белковых компонентов приведен в таблице.

Количество белка в группе компонентов и количество додецилсульфата натрия (ДДС-iNa), связанного с белком, находят по соответствующим стандартным калибровочным кривым, Гидрофобность групп бел1совых компонентов определяется количеством ДЦС-Na, связанным 100 мкг белка: чем вьше значения такого показателя, тем более гидрофобным является белок.

Известный способ позволяет определить лишь суммарную гидрофобность црепаратов белков, а предлагаемый способ после электрофоретического разделения позволяет дифференцировать по гидрофобности составляющие препарат компоненты и группы компонентов.

Повьшхение точности анализа достигается тем, что после электрофореза имеется возможность определить гидрофобность низкомолекулярных компонентов, которые по известному способу могут теряться в процессе диализа препаратов белка,

По прототипу суммарная.гидрофобность препарата зеина составила 0,90 мкг ДДС-Na на 100 мкг белка, а после электрофореза 0,80 мкг ДЦС-Na на 100 мкг белка При этом следует учитывать, что в полиакриламидный гель часть высокомолекулярных белков зеинового комплекса не входит,

Таким образом, предлагаемый способ определения гидрофобности белковых компонентов по сравнению с известным имеет следующие преимущества: не требует для своего выполнения доро-- гостоящих приборов и дефицитных реактивов, позволяет определять гидро

фобность составных частей гетерогенных белков, более чувствителен.

Фор м у ла изобретения

Способ определения гидрофобности белков, включающий обработку анализируемых белков одецилсульфатом натрия и связывание метиленового голубого, отличающийся тем, что, с целью усиления разрешают щей способности и повышения точности анализа, анализируемые белки предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле в трех параллельных дорожках, денатурируют три- хлоруксусной кислотой и первую дорожку инкубируют в 0,14-0,20 мМ растворе додецилсульфата натрия, освобождают гель от избытка детергента фосфатным буфером рН 7,0 и окрашивают 0,002 0,004%-ным раствором метиленового голубого, вторую дорожку окрашивают 0,002-0,004%-ным раствором метилено- вого голубого, третью окрашивают

0

Q 5

5

0,05%-ным раствором кумасси R-250 и после освобождения гелей от избытка красителей дистиллированной водой интенсивность окраски белков измеряют денситометрированием и по разности оптических плотностей первых двух дорожек судят о количестве связавшегося додецилсульфата натрия с белковой зоной, а по оптической плотности третьей дорожки находят количество белка с последующим расчетом количества додецилсульфата натрия,,на единицу белка согласно формуле

100-А-В - )

где А и В - количества додецилсульфата натрия, связавшегося с первой и второй дорожками соответственно, мкг; С - количество белка в данной пробе, огфеделенное по окрашиванию третьей до- рожки, мкго

Изобретение относится к области физико-химической биологии и биотехнологии и позволяет повысить разрешающую способность и точность анализа при исследовании физико-химических и функциональных свойств биополимеров. Гидрофобность белковых компонентов гетерогенного белка определяет после электрофоретического деления в поли- акриламидном геле и денатурации их по интенсивности связывания детергента - додёцилсульфата натрия и рассчитывают количество додецилсульфата натрия (мкг) на 100 мкг белка. 1 т абл. (Л «и сд О1