Способ определения проницаемости мембраны эритроцитов и концентрации кальция в цитоплазме Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 A61B6/00 

Изобретение относится к медицине и ;«)жет быть использовано для оценки состояния мембранных процессов при гипертонической болезни.

I Целью изобретения является повьше- нЦе точности при упрощении способа за сЦет применения изотопа Са в ,кон- ,ц«|нтрации t,0-4,0 мкКи/мп и регистра- цЦи его в эритроцитах через определен нфе сроки инкубации.

Способ осуществляют следующим образом.

Из взятой для биохимического анализа крови отбирают 5 мл и центрифу- гируют при 1000 g в течение 10 мин. Плазму и клетки белой крови удаляют. Отставшиеся эритроциты трижды промывают при тех же условиях центрифугирования в среде следующего состава: 150 мл NaCl и 5 мм Na-фосфатнрго бу- iepa (рН 7,4). К 1 мл упакованных эритроцитов добавляют 4 мл среды, содержащей 145 мМ NaCl, 5 шМ КС1, 1 тМ MgCl 1 мМСаС,, 10 мМ глюкозы, Ц мМ , 10 мМ трис-NCl .буфера 1рН 7,4), и 1 г на 100 мл среды сы- ророточного альбумина (V фракция). Суспензию эритроцитов инкубируют в течение 20 мин при 37° G, после чего д Добавляют, например, 50 мМ раствора |9-аминоДиметилкарбокси-7-метокси-2- (З-окси-4-аминометилкарбоксифенил)- хинолина в диметилсульфоксиде до конечной концентрации 150 мкМ. Суспен- зию эритроцитов инкубируют при 37 С в течение 90 мин. Нагруженная указанным соединением суспензия эритроцитов может непосредственно использоваться для дальнейшего анализа, а может и храниться при 0-2°С в течение 2 сут без изменения исследуемых параметров.

Суспензию в количестве 1,5 мл цен- |трифугируют при указанных условиях и (Дважды пpo ьюaют в среде, содержащей 145 мМ NaCl, 5 м КС1, 1 мМ MgCl,, 1 мМ CaCl, 10 мМ глюкозы, 1 мМ , 10 мМ трис-HCl буфера (рН 7,4), ресуспендируют в той же среде до конечного объема 1,5 мл и инкубируют при 37 С в течение 20 мин. В полученную суспензию добавляют радиоактивный изотоп Са в количестве 1,0- 4,0 мкКи/мл. Уменьшение радиоактивности меньше 1,0 мкКи/мл приводит к снижению точности измерения, так как количество изотопа, накапливаемого в клетках, недостаточно для достоверной регистрации на жидкостно-сцинциляцион

,

ном спектрометре. Увеличение концентрации более 4,0 мкКи/мл существенно не повышает точность измерения, но приводит к повьппению общего фона радиоактивности на рабочем месте и к повышению стоимости каждого ализа. Суспензию эритроцитов, содержащую Са, инкубируют при . Через 15 и 240 мин отбирают по 200 мкл суспензии, переносят ее в 1 мл среды, содержащей 150 мМ NaCl, трис-HCl буфера (рН 7,4; и 0,1 мМ ЭДТА, и центрифугируют при указанных условиях. Полученный осадок эритроцитов вновь промывают при тех же условиях и обрабатывают путем добавления 0,4 мл , 0,25%-ного раствора тритона X 100 и 0,5 мл 10%-ного раствора трихлорук- сусной кислоты. Белки осаждают при 2000 g в течение 10 мин, а 0,8 мл супериатанта переносят в диоксановый сцинцилятор и определяют радиоактивность. Указанные 15 и 240 мин являются оптимальным временем выборки, так как кинетика аккумуляции эритроцитами носит линейный характер вплоть до 30 мий инкубации. Поэтому в процессе определения проницаемости мембраны эритроцитов для кальция время. инкубации ограничено 15 мин. Кинетика аккумуляции Са эритроцитами достигает насыщения к 240 мин (4 ч) инкубации. Количество радиоактивного кальция, находящееся в клетках, к этому времени используют для расчета концентрации свободного кальция в цитоплазме.

Для определения проницаемости мембраны эритроцитов для кальция используют формулу

5

где К - проницаемость мембраны эритроцитов, нмоль/л клеток в 1 мин;

- радиоактивность Са в эритроцитах через 15 мин инкубации, срт;

а - удельная радиоактивность Са в среде инкубации, срт/нмоль;

i V - объем эритроцитов в пробе,л; t - время инкубации, мин. Для определения концентрации каль-, ция в цитоплазме используют формулу

к вгг

1«

lav

240

Id

В

где концентрация кальция в

эритроцитах, iiM; К 115нМ -константа сродства кальция к 9-амин6диметилкар- бокси- 7-метокси-2-(3- окси-4-аминометилкарбок- сифенил) тсинолину; радиоактивность Са в эритроцитах через 240 мин инкубации, ерш; - концентрация 9-аминоди- метилкарбокси-7-метокси- 2-(3-окси-4-аминометил- карбоксифенил)-хинолина, нмоль/л клеток.

Полученные величины скорости аккумуляции и свободной концентрации кальция в цитоплазме эритр1оцитов используют для оценки состояния мемб- раны.

П р и м е р 1. Воспроизводимость метода показана в результате проведения следующих исследований. У одного пациента в течение месяца делались заборы крови и определялись величины проницаемости мембраны эритроцитов для кальция и концентрация свободного кальция в цитоплазме.

В табл. 1 приведены результаты проницаемости мембр аЬы. эритроцитов для кальция (К) и концентрация кальция ( ССа ) в цитоплазме эритроцитов ..

Таблица 1

1429020

деляется с погрешностью не вьше fO% для К и 15% для ССа. Погрешность при определении величины К и с помощью известного метода составляет 60-70 и 30-40% соответственно (1-3),

Пример 2. Использование предлагаемого метода для оценки эффективности действия лекарственных препаратов (хинидина и трифторперазина) на состояние мембраны.

В табл. 2 приведены результаты влияния хинидина и трифторперазина на проницаемость мембраны эритроцитов для 1 альция и концентрацию кальция в цитоплазме эритроцитов.

Таблица2

Изобретение может быть использовано для оценки состояния мембранных процессов при гипертонической болезни. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. Суспензию эритроцитов инкубируют о и после добавления раствора 9-аминодиметилкар- бокси-7-метокси-2-(3-окси-4-аминоме- тилкарбоксифенил)-хинолина в диметил- сульфоксиде. Затем в суспензию добавляют изотоп Са в количестве 1,0 - 4,0 мкКи/мл. Регистрируют содержание кальция в эритроцитах через 15-20 и 2АО-260 мин инкубации. Определяют удельную активность Са в среде инкубации и объем эритроцитов. Затем рассчитывают проницаемость мембраны и концентрацию свободного кальция в цитоплазме. При гипертонической болезни скорость входа кальция в эритроциты увеличена на 25%. 3 табл. (С (Л

.5

+т

1052

890 953

965

950+30

96

45

103 87 50

93 93±3

55

Из анализа табл. 1 следует вывод о том, что статистически достоверно достигаемый результат измерения опре0

5

0

5

Из этих-результатов видно, что предлагаемый метод позволяет выявить влияние лекарственных препаратов на состояние мембраны при концентрациях 10 мкМ (хинидин) и 30 мкМ (трифтор- перазин). При использовании прототипа испытание этих веществ невозможно,так как они обладают собственной флуоресценцией .

Эффективность метода заключается в том, что его применение позволяет выполнять исследование проницаемости мембран с высокой точностью. Обследовано 35 больных гипертонической болезнью, 12 больных с вторичными формами артериальной гипертензии и 46 лиц контрольной группы, не имеющих симптомов артериальной гипертензии и указаний на наследственную отягщенность этим заболевание.

Результао-ы измерений приведены в табл. 3.

Таблица 3

46

980+41 98±5

35 1225+50 110+6

12 103Й+47 97+5

20

а б

V 0,001.

На основе статистического анализа дно, что скорость входа кальция в итроциты больных гипертонической лезнью увеличена по отношению к нтролю на 25% (р 0,00-1), что ука- цитоплазме определяют по формуле

-радиоактивность Са в э роцитах через 15-20 мин кубации, ерш; j. удельная активность Са

среде инкубации, срт/нмол объем эритроцитов в проб

t - время инкубации, мин, а Концентрацию свободного кальция

31|1вает на существование структурно- функциональных нарушений. Так как от- по этому параметру не обнаруже- у больных вторичными формами гиперл

Ф

нзии, то можно заключить, чте из- женные материалы могут быть исполь ваны для диагностического теста на едмет разделения гипертонической |лезни и вторичных форм гипертензии

ормула изобретения

Способ определения проницаемости ;мбраны эритроцитов и концентрации

м

кальция в цитоплазме путем насыщения

leTOK высокоселективным хелатором кальция, отличающийся т ем, что, -С целью повышения точности

и упрощения способа, добавляют изотоп Са в концентрации 1,0 - 4,0 мкКи/мл, регистрируют содержание его в эритроцитах через 15-20 мин и 240-260 мин инкубации, определяют удельную активность в среде И1 кубации и объем эритроцитов, при этом проницаемость мембраны определяют по формуле

где К

)У-2о

а V цитоплазме определяют по формуле

-проницаемость мембраны эритроцитов, нмоль/л клеток в 1 мин:

4 Г

-радиоактивность Са в эритроцитах через 15-20 мин инкубации, ерш; j. удельная активность Са в

среде инкубации, срт/нмоль; объем эритроцитов в пробе, л;

цитоплазме определяют по формуле

t - время инкубации, мин, а Концентрацию свободного кальция в

где

0

нМ

5

0

Гг,1 - к А24о по Са J - К тг-7- ,

Са - концентраи 1Я свободного кальция в цитопл.азме,нМ; константа сродства кальция к 9-аминодиметилкарб- окси-7-метокси-2-(3-oкcи- 4-aминoмeтилкapбoкcифe- нил)-xинoлинy; радиоактивность Са в эритроцитах через 240 - 260 мин инкубации; - концентрация 9-аь1Инодиме- тилкарбокси-7-метокси-2- (З-окси-4-аминометилкарб- оксифенил)-хинолина, нмоль/л клеток в 1 мгн.

% -2йо

В