Способ получения рекомбинантного штамма S-формы патогенных эшерихий Советский патент 1990 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к медицине а именно к микробиологии. Предлагаемый способ может быть использован для получения новых генетических вариантов патогенных эшерихий с запро граммированными изменениями в геноме. Такие штаммы необходимы для отбора йродуцентов вакцин, а также для изучения молокулярно-генетичес- ких основ регуляции вирулентности, антигенибй иэмейчийости и уточнения генетических карт;.. I .

Цель изобретения - -получение ре- комбинантньтх Мгаммов патогегтных згагр:;хий q заданными свойствами. Способ осуществляют следующим образом.

Трансдуцируюший бактериофаг Р1 выращивают на культуре-доноре. Для зтого 2,5 мл 0,7%-ного аминопептид- ного агара при 45-46 С смешивают с 2,0-3,040 бактерий и 1,0-2, фаговых частиц, выпивают на чашки с застывшим 1,5-2,0%-ным аминопеп- тидным агаром и смесь выращивают 15-20 ч при 36,6-37,2 с, после чего смывают 0,7%-ный агар, добавив 1,0- 2,0 -мл аминопептидного бульона. К полученной смеси добавляют 0,3 - 0,5 мл хлороформа, встряхивают 30 - 40 с и разделяют центрифугированием при 2000,0-3000,0 об/мин 20-30 мин. Отбирают надосадочную жидкость, ко- Topas. представляет собой лизат фа- ,га Р1 .

В случае получения у-меренного варианта фага Р1 (Р.1 cml, clr 100) культуру-донор выращивают при 30- З2 с в аминопептидном бульоне до концентрации бактериальных клеток 2,0-2, в мл.Индуцируют фаг, инкубируя бактериальную культуру 35-W мин при 40-4 КС и 60-65 мин при 36,6-37,.Затем к бульону добавляют 1/10 объема хлороформа и смесь встряхивают 30-40 с. Фаголи зат отделяют центрифугированием при 2000-3000 об/мин 20-30 мин.

Для осуществления трансдукции бактериальную культуру-реципиент выращивают в аминопептидном бульоне в течение 15-17 ч, разводят 0,85 - 0,90%-ным раствором хлорида натрия в 3-5 раз и осаждают центрифугированием при 2500-3000 об/ми в тече- ние 30-35 мин при 18-22 С. Надосадоную жидкость сливают, осадок ресус- лендируют в прежнем объеме pacTsopo

5

5

0 0

5

5

0

5

0

хлорида и нновь осаждают при таком же режиме центрифугирования. Процедуру отмьшки повторяют 3-5 раз. Из обработанных таким образом бактерий готовят пзвесь, содержащую 1,0 - 2,0 МО живых клеток в t мл. К 1,0мл такой взвеси добавляют трансдуцирую- щ тй бактериофаг в концентрации 1,0- 2,040 (0,1 мл), после чего смесь инкубируют при 36,6-37,2°С в водяной бане в течение 40-45 мин а затем пр 18-22 С - 120-130 мин. Смесь центрифугируют при. 2500-3000 об/мин 20-30 мин при 18-22 С для осаждения бактерий. Надосадочную жидкость, содержащую неадсорбированные фаговые частицы, сливают. Осадок ресуспенди- руют в 0,3-0,4 мл раствора хлорида натрия и засевают по 0,15-0,2 мл на чашки с селективной средой. Траг.- сдуктанты выращивают в течение 48- 5.0 ч. Отбирают колонии, соответствующие S-формам бактерий.

Пример 1. Передача гена tif 1 от культуры 1М12Тп10.

Исходный фаг в колич.естве 1,0 «10 смешали с 2,0«10 клеток-доноров, добавили 2,5 мл 0,7%-ного аминопеп- тидного агара при и после сме- шивания вылили на чашку с 1,5% амино- пептидным агаром. Смесь выращивали 17 ч при 37°С, после чего 0,7%-ный. агар был смыт при добавлении 2,0 мл аминопептидного бульона. К полученной смеси добавили 0,5 мл хлороформа, смесь встряхивали 40 с и затем разделяли центрифугированием при 3000 об/мин 20 мин. Отобрали надосадочную жидкость, которая представляла собой лизат фага Р1.

Культура-реципиент эшерихий 0,124 в S-форме - вирулентный штамм VT 1240, Вьфащенные в аминопептидном бульоне в течение 15 - 17 ч бактерии развели 3 разг 0,Ь5%-ным раст-: вором хлорида натрия и осадили центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин при. 20 С. Надосадочную жидкость слили, осадок ре- су с пен ди ров али в прежнем объеме раствора хлорида натрия и снова осадили. Процедуру повторили 4 раза. После четвертого: осаждения из бактерий была приготовлена взвесь, со держащая 1,0-10 клеток в 1 мл. К 1,0 мл такой вэвеси добавили 1,0«10.

3

трансдуцирующего бактериофага (бактериофаг 6bui предварительна оттиро- ван по методу Граииа на индикаторно культуре QD,500). После добавления бактериофага смесь инкубировали при 37, в водяной бане 45 мин, а затем 120 мин при ZO C, После инкубации смесь центрифугировали для осаждения бактерий при 3000 об/мин в течение 30 мин при 20 С. Надоса- дочную жидкость, содержащую неадсорбированные фаговые частицы, слил и осадок ресуспендировали в 0,3 мл раствора хлорида натрия. Затем полученную взвесь высеяли на.две чашк с аминопептидной средой, содержащей тетрациклин t5 мкг/мл. Чашки инкубировали 48 ч при . Среди колоний, выросших на чашках, отбирали только соответствующие S-формам. Для;отбора tif 1 вариантов (tif 1 соответствует гену гее А 441) отобранные колонии р ассевались на аминопептидной среде, содержащей тетрациклин 15 мкгДш и выращивались 48 ч при . Полученные после этого колонии проверялись на способность к росту минимальной среде М9 с минимальным агаром 1,5% (Dlfco). Для этого с герильными спичками каждая

Составитель Н.Кузенкова Редактор Л.Лашкова Техред В.Кадар Корректор:С,Черни

. Заказ 4353 Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР . . по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1 4

испытуемая колония пересевалась на две чашки с этой средой. Чагаки выращивались: одна при , другая при 42 С (известно, что tif 1 варианты не способны расти при ). Через 48 ч инкубации отобрали ко- , лонии, давшие рост при и не давшие при . Они соответствовали рекомбинатам с желаемыми свойствами tif 1 тпЮ,

Для отбора трансдуктантов в проведенных экспериментах были использованы следующих их свойства: транс- дуктанты, содержащие гены, кодирующие устойчивость к тетрациклину

(тпЮ), растут на аминопептидном агаре, содержащем 10-15 мкг/мл соответствующего антибиотика, транедуктанты, приобретшие ген гее А 56, идентифиЦируются по возрастанию в 1000 - 10000 раз чувствительности к УФ-об- - лучению, трансдуктанты, получившие ген tif 1, теряют способность.расти на минимальной среде М9 при и растут при 32 С.

Предлагаемый способ позволяет впервые получить рекомбинаты патогенных эшеризий, находящихся в S- форме, при трансдукции фагом Р1.