Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI VT 2240, используемый для получения диагностической О-сыворотки к эшерихиям серовара 0124 Советский патент 1990 года по МПК C12N1/20 A61K39/395 C12N1/20 C12R1/19 

оо оо оо

t1

Изобрс гпиие отиосчтся к мсгдипии- ской микробиологии н -может быть ис- польгзопано в производстве сыпороточ- ных препаратов.

Целью изобретения является создание нового авирулентного штамма, пригодного для получения специфической сыворотки.

I

Штамм бактерий Е. coli VT 22АО получен следующим образом.

2,5 мл 0,7% аминопептидного агара при температуре смешивают с 2,0-10 клеток эшерихий 1C 10240 и 1.,0-10 фаговых частиц (фаг PI vir), выливают на чагаку с застывгаим 2, аминопептиднмм агаром, и смесь выращивают при температуре 37°С в течение 20 ч, после чего смывают 0,7%-нЬ1Й агар, добавив 2,0 мл aMnfionenTi Horo бульона, К полученной смеси добавляют 0,5 мл хлороформа, встряхивают ДО с и затем разделяют цкнтрифугирдванием при 3000 об/мин 30 мин. Отбирают надо- садочнуго жидкость, представляющую собой лизат фага Plvir. Дпя осуществления трансдукции бактериальную культуру - реципиент VTI 240 выращивают на амино- пеп 1-идном бульоне в течение 15-16 ч, разводят 0,85%-ным раствором хлорида натрия в 3 раза и осаждают центри фугированием при 2500 об/мин в течеш е 30 мин при 20°С. Надосадоч- ную жидкость сливают, осадок ресус- пендируют в прежнем объеме раствором хлорида натрия и вновь осаждают при том же режиме цeнtpифyгиpoвaния. Процедуру отмывки повторяют 4 раза. Из обработанных таким образом бактерий готовят взвесь, содержащую 1,0 xlO живых клеток в 1,0 м.л, К 1 ,0 мл такой взвеси добавляют трансдуциру- Ю1ЦИЙ бактериофаг в концентрации 2,0 Ю клеток (0,1 мл), после чего инкубируют смесь при 37°С в водяной бане в течение 45 мин, а затем при 22 С в течение 30 мин, Цеитрифугируг ют смесь при 2500 об/мин 30 мин при 20 С для осаждения бактерий, Надоса- дочпуто жидкость, содержащую неад- сорбированнр 1е фаговые частицы, сливают. Ресуспендируют осадок в 0,3 мл раствора хлорида натрия и засевают по 0,15 мл на чашки с аминопептид- ным агаром, содержащ Ш 10,0 мкг/мп тетраинклина. Трансдуктанты выращивают в тгче нне 48 ч. Отбирают коло/8370

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

НИИ, соответствующие S-формям. Отоб-- ранные клоны проверяют на чувстпи- TejibHocTb к ультрафиолетовому облучению, для этого засевают параллельными штрихами, идущими через всю поверхность чашки Петри с 2%-ным ами- нопептидным агаром. Половину чашки облучают УФ в дозе 20 Дж/м и после этого инкубируют в темноте при 37, в течение 18 ч. Трансдуктанты, приобретгаие ген гёс А 56, не дают роста на облученной стороне чашки. В то же время клетки, несущие исходный тес А ген, малочувствительны в данной дозе КФ и дают нормальный рост на облученной и необлученной сторонах чашки Петри. Отобранный таким образом штамм повышенной чувствительности к УФ обозначен VT 2240.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ГИСК им. Л. А. Та- расевича под № 135 и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические и физиолого-биохими.ческие признаки.

Грамотрицательная неподвижная палочка, находящаяся в форме, дающая положительную реакцию с метил- ротом и отрицательную с фогес-Прос- кауэра.

Растет на основных питательных средах (амино- и мясопептонной среде, Эндо, Левина, синтетической среде М9), имеет характерную для данного серовара биохимическую активность, чувствительность к антибиотикам и антигенную структуру (табл. 2,3).

В области srl гена (ферментация сорбита) встроен транспозон Тп 10, это определяет отсутствие ферментации сорбита и устойчивость к тетрациклину. За счет замены гее А гена на мутантный гее А 56 ттамм VT 2240 имеет в 1000-10000 раз повьппенную чувствительность к УФ и практически лишен способности к законной рекомбинации ДНК.

Пример. Для получения 0-аг- глютинируюпщх сывороток против зше- рйхий серовара 0124 проводят иммунизацию кроликов. выращивают на аминопептидном или мясопептонном скошенном агаре в течение 22 ч при 37 С. Микробную массу смывают физраствором и готовят чявесь. содержащую 10 м.кл./мл. Кропику подкожно

вводят 1 мл микробной взвеси. Через 4-5 дней I,0 мл аналогично приготовленной микробной взвеси вводят кролику внутривенно. Через 4 дня BBQ- дят 2,0,мл такой же микробной взв е- си, и еще через 4 дня - А мл микробной вйвеси. На 8-й день после последнего введения кролика обескровливают и отделяют сыворотку. Получен- мая сыворотка содержит антитела в титре 1:6400 (развернутая реакция агглютинации, табл. 4),

Использование авирулентного штамма Е. coli fr 135 позволит получать специфическую сыворотку высокого титра. Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli VT 2240, № 135 (коллекция ГНШСК медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича), используемый для получения диагностической 0-сыворотки к зшерихиям серовара 0124.

Таблица

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в производстве сывороточных препаратов. .Цель изобретения - создание нового авирулентного штамма, пригодного для получения специфической сыворот1 и. Штамм п6 - лучен генетическим путем, депонирован в коллекции ткроорганизмов ГИСК им. Л. А. Тарасовича под If 135. При иммунизации кроликов получают иммунную сыворотку с титром 1; 6400. 4 табл.

Характер роста вагтвриЛ ктаима Vt2240 иа pasmtniant геитатвльпш средах

КГ

К{6-7 сутки)

КГ

К - ферментация до кислоты КГ - ферментация до кислоты и газа.

Таблида 2

Феркентативяая астввность

« «nnrtnoTtnian linvnt япмп)

S - , V УСТОСЧКМЙ,

- лиомтр «OHM )mi«T«ii роста

Ра«я еряут 1я реакция агглютияацки

Штанм

К

я

I

Ж

ж

ж

ж - псявлл культура К кмпячвпая культура,

йоя8лет1« агглютияавяи я динамике разведения сыворотки яарахтаряо для

живых и кипячвюлх культур «аернхий серов&ра 012й.

Таблица- 4