Питательная среда для обнаружения микроорганизмов рубца,усваивающих азот мочевины Советский патент 1987 года по МПК C12N1/20 C12N1/20 C12R1/04 

11

Изобретение относится к микробиологии, а именно к питательным средам для культивирования микроорганизмов, усваивающих азот небелковых соединений, в частности азот мочевины, и мо жет быть использовано в практике корления для объективной оценки вклада микроорганизмов в аминокислотное и протеиновое питание жвачных животных Цель изобретения - повышение чувствительности среды и точности выделения .

Изобретение заключается в том, чт осуществляют подбор компонентов среды из расчета оптимального соотно шения мочевины к углеводам как 1:5-1 а также более полного удовлетворения потребности Рубцовых микроорганизмов в стимуляторах роста за счет введения цианкобаламина, холинхлорида и натрия изомаслянокислого.

В услоБР ях вивария института на лактирующих коровах, имевших фистулы рубца и внешние анастомозы 12-ти перстной кишки, проведено 3 опыта.

Изучали микробиологические процессы в рубце коров при введении в их рацион протеина разной деградируемос ти, которая в опытах 1, 2 и 3 составляла 53,1; 48,8 и 76,9% соответственно .

Пробы содержимого рубца для микробиологических исследований берут через 3 ч после утреннего кормления жи вотных в конце каждого опыта.

Готовят среду следующего состава, мг/л:

Калий фосфорнокислый однозамещеггный225,0

Калий фосфорнокисльй

двузамещенный225,0

Натрий хлористый 445,0 Нагннй сернокислый 45,0 Кальций хлористый 45,0 Марганец сернокислый 20,0 Железо сернокислое 20,0 Цинк сернокислый2,0

Медь сернокислая2,0

Кобальт хлористьй 2,0 Резазурип 0,1%-ный раствор1000,0 Натрий уксуснокислый 500,0 Натрий лимоннокислый 200,0 Натрий валериановокислый20,0

Натрий изовалерианово- кислый20,0

Натрий изомасляно- кислый20,0

0

5 5

5

Тиамин солянокислый 2,0 Никотиноаая кислота 2,0 Пантотеновая кислота 2,0 Рибофлавин2,0

Пиридоксин2,0

Холинхлорид2,0

Фолиевая кислота0,5

Нарааминобензойная кислотаО,1

Биотин0,05

Цианкобаламин0,05

Глюкоза6000,0

Целлобиоза600,0

Крахмал1000,0

Мочевина1000,0

Агар-агар20000,0

Натрий серноватисто- к;1слый250,0

Натрий сернокислый 250,0 Натрий двууглекислый400,0 Дистиллированная вода Остальное Отношение мочевины к углеводам в среде составляет 1:5-10. - Берут 5 мл полученной среды и засевают содержимым рубца, разведенным в растворе в количестве 0,5 мл.

Результаты по численности микроорганизмов, выросших на предлагаемой среде, представлены в табл. 1 (в содержимом рубца у коров).

Таблица 1

0

4,93±0,,23 5,3010,63 4,87iO,42

24,43±0„32 4,97+0,59 4,53±0,45

35,97+0,71 6,31±0,35 5,70±0,96

О чувствительности предлагаемой среды судят по числу выросщих на ней колоний (табл. 2).

Результаты сравнительной оценки эффективности исследований численности микроорганизмов при культивировании на испытуемых средах приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что с помощью предлагаемой среды удается вьщелять на 5-15% больше бактерий, использую- ,щих азот мочевины, чем на среде, взятой за прототип, т.е. эта среда более полно удовлетворяет потребности ука- ванных микроорганизмов в стимуляторах роста.

Пример 1. Выращивание микроорганизмов, усваивающих азот мочеви

ны, проводят в анаэробных условиях при 39°С в течение 24 ч. Готовят среду следующего состава, мг/л:

Калий фосфорнокислый

однозамещенный225,0

Калий фосфорнокислый

Амнлазная активность, ед/мл

Химически;) состав 6; дмассы, г/100 г сухого зезйствл; Белок

Углез.1лы:

растворимые

легко гидролизуечые Всего:

2,58iO,31 27,9911,672,15tO,83 24,5i2,08,3iO,85 31,,66

34,,38 49,7±1,8334,3tl,87 50,,9536.2t1,54 43,9l3,71

9,7iO,77 5,6tO,347,8tO,63 5,7tO,33 8,,68 3,410,74

38,,0 27,9t3,7141,012,99 28,3tl,2537,It3,18 29,812,07

i8,0 33,548,8 34,046,0 35,2

5

0 -

0

514

Цинк сернокислый2,0 Медь сернокислая2,0 Кобальт хлористый2,0 Резазурин 0,1%-ный раствор1000,0 Натрий уксуснокислый500,0 Натрий лимоннокислый200,0 Натрий валерианово- кислый20,0 Натрий изовалерианово- кислый20,0 Натрий изомаслянокислый 20,0 Тиамин солянокислый2,0 Никотиновая кислота2,0 Пантотеновая кислота2,0 Рибофлавин2,0 Пиридоксин2,0 Холинхлорид2,0 Фолиевая кислота0,5 Парааминобензойная кислотаО,1 Биотин0,05 Цианкобаламин0,05 Глюкоза6000,0 Целлобиоза600,0 Крахмал1000,0 Мочевина1000,0 Натрий серноватисто- кислый250,0 Натрий сернокислый250,0 Натрий двууглекислый400,0 Дистиллированная водаДо 1 л Контролем служит известная по прототипу жидкая синтетическая среда.

35

51

Из табл. 3 видно, что при выращивании микроорганизмов рубца на предлагаемой среде их амилазная активность в 7-12 раз выше, чем при выращивании на известной среде.

Изучение химического состава микробных препаратов показало, что содержание протеина в биомассе бактерий, выращенных на известной среде, было на 35-А6% ниже, а углеводов на 31-43% выше, чем при культивировании на предлагаемой среде, что объясняется наличием значительного количества неиспользованного крахмала в известной среде.

Исследованиями установлено, что п мере добавления к питательной среде мочевины происходит увеличение накопления биомассы стрептококков. Наи большее накопление бактериальной массы отмечено при соотношении мочевины к крахмалу в пределах 1:5-10. Эти оптимальные соотношения мочевины к крахмалу в питательной среде обусловливают не только максимальное наПример2. С целью доказательства воздействия на жизнедеятельность чистых культур амилолитических стрептококков Streptococcus bovis выделен-20копление биомассы, но и повышенный ных на предлагаемой среде, таких фак-синтез амилазы бактериями. Дальней- торов, как соотноше}ше мочевины ишее увеличение мочевины подавляло крахмала в среде, был проведен специ-биосинтетическую и ферментативную альный опыт. Для этого культуры, об-активность микробов. Следовательно, ладающие амилолитической активностью, 25среда, имеющая более широкое отношевыращенные на предлагаемой среде, пересевают на жидкую среду с крахмалом. При этом концентрация крахмала в питательной среде постоянна (1000 мг/л), а количество мочевины увеличивают от 50 до 1000 мг/л (табл. 4).

Таким образом, получают соотношения мочевины к крахмалу от 1:20 до 1:1.

50 100 200 300 400 500 1000

В качестве посевного материала служила суточная культура бактерий Str. bovis, которую вносят в среду из расчета 2% к ее объему и инкубируют в анаэробных условиях при 39 С.

Интенсивность роста культур контролируют на ФЭК-56М при длине волны 630 им и выражают в единицах оптической плотности,

Исследованиями установлено, что по мере добавления к питательной среде мочевины происходит увеличение накопления биомассы стрептококков. Наибольшее накопление бактериальной массы отмечено при соотношении мочевины к крахмалу в пределах 1:5-10. Эти оптимальные соотношения мочевины к крахмалу в питательной среде обусловливают не только максимальное накопление биомассы, но и повышенный синтез амилазы бактериями. Дальней- шее увеличение мочевины подавляло биосинтетическую и ферментативную активность микробов. Следовательно, среда, имеющая более широкое отношение мочевины к крахмалу, чем 1:3-10, не в полной мере обеспечивает потребность стрептококков в азоте, а среда с более узким соотношением создает

0 избыток в азоте, и использование его снижается.

Влияние соотношения в среде моче- к крахмалу на накопление биомассы и амилазную активность Str. bovis

J5 показано в табл. 4. 1

Таблица4

С,44±0,02 0,53±0,02 0,5010,01 0,46+0,02 0,42±0,01 0,39tO,02 0,26iO,01

Преимущества предлагаемой питательной среды в том, что она более полно удовлетворяет потребности рубцовых микроорганизмов, усваивающих азот небелковых соединений, в стимуляторах роста при отношении мочевины к углеводам в пределах 1:5-10, что способствует ускорению их роста на 5-15% и повышению амилазной активности в 7 12 раз по сравнению с прототипом, за счет чего обеспечивается повышение чувствительности и точности обнаружения .

Предлагаемая среда.дает возможность получить объективную оценку вклада микроорганизмов, используюя1их азот мочевины, в аминокислотное и протеиновое питание жвачных животных

Применение этой среды позволит глубже изучить закономерности тече- НИН микробиологических процессов в преджелудках жвачных животных с целью повышения эффективности использования питательных веществ рациона,

Формула изобретения

Питательная среда для обнаружения микроорганизмов рубца, усваивающих азот мочевины, содержащая углеводы - глюкозу, крахмал, целлобиозу, минеральные соли - натрий уксуснокислый, натрий лимоннокислый, натрий валериа новокислый, натрий изовалерианово- кислый, калий фосфорнокислый одноза- мещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий хлористый, марганец сернокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, железо сернокислое, медь сернокислая, цинк сернокислый, кобальт хлористый, натрий углекислый натрий сернокислый, натрий сернова- тистокислый, резазурин, тиамин солянокислый, никотиновую кислоту, панто теновую кислоту, рибофлавин, пиридок син, фолиевую кислоту, парааминобен- зойную кислоту, биотин, агар-агар, мочевину и дистиллированную воду, отличающаяся, тем, что, с

Составитель И.Привалова Редактор М.Бандура Техред А.Кравчук Корректор И.Муска

Заказ 1497/23 Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

елью повышения чувствительности среы и точности выделения, она дополниельно содержит в качестве стимулятоов роста натрий изомаслянокислый, олинхлорид и цианкобаламин, а соотошение мочевины к углеводам устанавивают 1:5-10 при следующем соотноении компонентов, мг/л: Калий фосфорнокислый однозамещеннь 200-250 Калий фосфорнокислый двузамещенный200-250

Натрий хлористый 400-500 Магний сернокислый 40-50 Кальций хлористый 40-50 Марганец сернокислый 15-25 Железо сернокислое 15-25 Цинк сернокислый 1,5-2,5 Медь сернокислая 5 Кобальт хлористый 1,5-2,5 Резазурин800-1200

Натрий уксуснокислый 450-550 Натрий лимоннокислый Натрий валерианово- кислый15-25

Натрий изовалерианово- кислый15-25

Натрий изомаслянокислый 15-25 Тиамин солянокислый 1,5-2,5 Никотиновая кислота 1,5-2,5 Пантотеновая кислота 1,5-2,5 Рибофлавин1,5-2,5 .

Пиридоксин1 ,5-2,5

Холинхлорид1,5-2,5

Фолиевая кислота 0,25-0,75 Парааминобензойная кислота0,05-0,15

Биотин 0,025-0,075

Цианкобаламин 0,025-0,075 Глюкоза3500-8500

Целлобиоза250-950

Крахмал500-1500

Мочевина. 800-1200

Агар-агар18000-22000

Натрий серноватисто- кисльй200-300

Натрий сернокислый 200-300 Натрий углекислый 350-450 Дистиллированная вода Остальное

Изобретение относится к микробиологии, а именно к питательным средам для обнаружения микроорганизмов рубца, усваивающих азот мочевины. Цель изобретения - повышение чувствительности среды и точности выделения. Среда дополнительно содержит натрий изомаслянокислый, холинхлорид и циан- кобаламин при соотношении мочевины. и углеводов 1:5-10. В результате использования предлагаемой среды интенсивность роста микроорганизмов, использующих азот мочевины, повышается на 5-15%. Амилазная активность микроорганизмов возрастает в 7-12 раз по сравнению с известной средой Кучин- ского. Изобретение может быть использовано в научных исследованиях и в практике кормления жвачных животных для объективной оценки течения микробиологических процессов в преджелуд- ках и вклада микроорганизмов, усваивающих азот мочевины, в аминокислотное и протеиновое питание жвачных животных. 4 табл. (О (Л